01. Molekularna Genetika

Biokemija II MOLEKULARNA GENETIKA 07/08

MOLEKULARNA GENETIKA

35. Prenos in ohranjanje genetske informacije

Genom : 3x109 baznih parov1 kromosom: 30x 106- 260x106 baznih parov

35.1. Genetska dogma.Centralna genetska dogma postavlja temelje molekularne biologije in kemije. Govori o tem, da se proteini, oziroma AK v proteinih, ne morejo prepisati v DNA, potem ko so enkrat nastali s transkripcijo, medtem ko je obratna pot možna. DNA se množi z replikacijo (DNA -> DNA), lahko se kopira v RNA (DNA -> RNA), s pomočjo RNA pa v ribosomih s translacijo nastajajo proteini (RNA -> proteini). Posebna vrsta transkripcije je pot iz RNA v DNA z encimom reverzno transkriptazo, kopiranje RNA v RNA pri virusih in direktna translacija iz DNA v proteine (možno le v laboratoriju).

35.2. Vloga informacijskih makromolekul v celici.Za DNA, RNA, proteine in nekatere ogljikove hidrate pravimo, da so informacijske molekule, ker v svoji kemijski zgradbi nosijo navodila za uravnavanje bioloških procesov. Biopolimeri so sestavljeni iz monomernih enot, ki so povezane v stabilne strukture, njihovo zaporedje pa zapisuje informacijo. Branje sporočila na ravni makromolekul temelji na vzpostavitvi šibkih nekovalentnih vezi med biomolekulami. Informacija se z DNA prenese na RNA in se preko le-te izrazi kot protein, ki so molekulsko orodje, ki usmerja in izvaja najrazličnejše procese v celici. DNA je preko informacije za sintezo proteinov, posredno preko RNA, povezana z izvedbo in uravnavanjem vseh kemijskih reakcij v celici.

35.3. Princip in pomen komplementarnosti.Komplementarno parjenje baz je najpomembnejša lastnost dvojne vijačnice, ki ji omogoča, da shranjuje in prenaša genetsko informacijo. V parih si stojita vedno nasproti purin (A ali G) in pirimidin (T ali C). Takšna kombinacija omogoča največje število vodikovih vezi in tudi baznim parom daje največjo stabilnost. Razdalja med verigama je ravno pravšnja, da ustreza paru pirimidin-purin, saj je premajhna, da bi si lahko nasproti stala dva purina, in prevelika, da bi se dva pirimidina povezala z močnimi vodikovimi vezmi. Navadno se baze povežejo takole: A = T, G Ξ C in se, zaradi hidrofobne narave, nahajajo v notranjosti molekule.Dvojna vijačnica je zelo stabilna struktura, a se lahko odpre (ravno prav šibke interakcije, kooperativni efekt) oz. pod določenimi pogoji denaturira (segrevanje, kisline, baze, organska topila).

36. Podvajanje DNAEndonukleaza- cepi nukleotide na sredini verigeEksonukleaza- cepi nukleotide s 5' oz. 3' konca

1


36.1. Splošne značilnosti podvajanja DNA. Prekurzorji verige so 5' dNTP-ji (deoksinukleotrifosfati). Gre za reakcijo dodajanja nukleotidov, transesterifikacijo, pri kateri se odcepi

pirofosfat in porabita dve molekuli ATP. Po cepitvi dobimo dva prosta fosfata. Med dvema nukleotidoma nastane fosfodiesterska vez.

Splošna reakcija polimerizacije:

Podvajanje je semikonzervativno, kar pomeni, da je vsaka novo nastala molekula DNA sestavljena iz ene nove in ene stare verige DNA.

Podvajanje vedno poteka od 5' (prosta fosfatna skupina) proti 3' (prosta OH skupina) koncu.

Podvajanje je semidiskontinuirano. Zaradi določene smeri podvajanja ločimo vodilno in sledilno verigo.Vodilna veriga se lahko nemoteno prepisuje od začetka do konca, medtem ko sledilna veriga nastaja v več delcih. Tem delcem pravimo Okazakijev fragmenti in so običajno dolgi okoli 230 (1000-2000 pri prokariontih) baznih parov (bp).

Da podvajanje poteka hitreje je celotna molekula pri evkariontih razdeljena v več fragmentov, ki jim pravimo replikacijski mehurčki. Dolgi so od nekaj 10 do nekaj 100 tisoč bp.

36.2. Začetek

podvajanja DNA.Sprva se na molekulo DNA veže helikaza, encim, ki razklene verigi in skrbi za nastanek replikacijskih vilic. Da verigi ostaneta razklenjeni se nanje vežejo določeni proteini (SSB ali RPA). Encim, ki izgrajuje novo verigo, se imenuje DNA polimeraza. Polimeraza se veže na verigo DNA, vendar za to potrebuje začetni oligonukleotid (primer), ki ga sestavlja 8-10 nukleotidov RNA in ga izgradi encim primaza. Poleg tega, da služi kot vezavno mesto za encim, ima začetni oligonukleotid tudi

pomembno vlogo pri zmanjševanju možnosti nastajanja napak. Učinkovitost polimeraze je namreč odvisna tudi od števila že vezanih nukleotidov, saj manj ko jih je, počasneje in manj zanesljivo deluje. Brez oz. s prekratko začetno verigo, bi na začetku vsakega fragmenta nastalo veliko napak.

2


36.3. Proteini, vključeni v podvajanje DNA.Prokarionti

§ Helikaza je encim, ki razklene verigi molekule DNA in s tem skrbi za pomikanje replikacijskih vilic. Ko se veže na verigo, po njej počasi drsi, za kar potrebuje energijo ATP.§ Primaza izgradi začetni oligonukleotid in se vedno nahaja takoj za helikazo.§ SSB proteini preprečujejo nastajanje struktur znotraj verige DNA (npr. lasnic) in ponovno zvitje verig. Delujejo kooperativno, saj je, ko se en protein veže, vezava naslednjega olajšana.§ DNA polimeraze so encimi, ki imajo endo- in eksonukleazno funkcijo. Eksonukleazna aktivnost je sposobnost encima, da lahko odcepi končni nukleotid. To lahko naredi na 5' ali 3' koncu. Poleg tega s sposobnostjo selekcije nukleotida v aktivnem mestu in proof-readinga, skrbijo za natančnost podvajanja. Proof-reading je le drugo ime za omejitev endonukleazne aktivnosti samo od 5' proti 3' koncu. Polimeraze so procesivni encimi, kar pomeni, da lahko isti encim na verigo doda več nukleotidov zapovrstjo. Tako polimeraza I lahko doda do 200, polimeraza III pa kar do 5000 bp zapovrstjo.Nasprotje so distributivni encimi, ki po končani reakciji substrat spustijo in se vežejo na naslednjega. Polimeraza III je zgrajena iz 3 podenot. Prva

podenota služi vezavi na vodilno verigo DNA. Verigo obda in služi kot drseči obroč ter tako poveča hitrost podvajanja. Druga podenota ima endonukleazno aktivnost. Ker je podvajanje semidiskuntinuirano, se tvori asimetričen dimer.

Polimeraza I ima tako ekso- kot endonukleazno aktivnost.

§ Ligaza omogoča povezavo krajših segmentov v enotno verigo z vzpostavitvijo fosfodiesterske vezi. Za svoje delovanje potrebuje NADH.§ Giraza oz. topoizomeraza II rešuje topološke probleme, ki nastajajo med odpiranjem verig. Pozitivno superzvitje spreminja v negativno in tako omogoča normalen potek podvajanja.Topoizomeraza I ima podobno funkcijo prejšnji, vendar lahko cepi le eno verigo DNA in zato ne sodeluje pri podvajanju. Medtem, ko lahko prokariontska reže le negativno zvito molekulo, lahko evkariontska popravlja tako pozitivno kot negativno zvito molekulo.

36.4. Mehanizmi podvajanja DNA.Prokarionti: sintezo opravi asimetrični del polimeraze III Vodilna veriga se sintetizira nepretrgoma od začetka do konca, medtem ko se sledilna veriga sintetizira po posameznih fragmentih. Vsakič, ko se začne sinteza novega delčka, je potreben nov začetni oligonukleotid. Sčasoma se nov fragment toliko podaljša, da doseže primer starega Okazakijevega fragmenta. Ob stiku nove verige s starim primerjem, se le ta odmakne od polimeraze III. Polimeraza I z eksonukleazo odstrani stari primer in nato izpolni nastalo vrzel z deoksinukleotidi. Eksonukleazna aktivnost nima določene smeri delovanja, vendar je zaradi nizke procesivnosti pri delovanju od 3' proti 5' koncu verjetnost, da bi namesto primerja odstranila končni del novo nastalega fragmenta, izredno nizka. Na koncu ligaza vzpostavi fosfodiestersko vez med fragmentoma.

3


Evkarionti:Podvajanje DNA pri prokariontih se bistveno razlikuje samo pri sintezi sledilne verige.

Primaza izgradi 10 nukleotidov dolg začetni oligonukleotid in nanj polimeraza α doda še 15-20 deoksinukleotidov dolg fragment in se nato odcepi skupaj s primazo.

36.5. Mehanizmi, ki zagotavljajo natančnost podvajanja.

Ж Problemi podvajanja telomernih regij.Telomerne regije so nekodirajoči konci

kromosomov, ki so sestavljeni iz številnih T in G ponovitev. Dolgi so nekaj 1000 bp. Na vsakih 50 do 60 celičnih delitev se skrajšajo za 10-15 (zarodne celice 3-5) kilo baznih parov (kbp). Da bi bilo tega krajšanja čim manj, skrbi encim telomeraza, riboprotein sestavljen iz proteina in okoli 150 nukleotidov dolge RNA. Zaporedje nukleotidov je komplementarno ponovitvam v telomerni regiji in se v posameznih organizmih razlikuje.Telomeraze ščitijo kromosome, vendar se njihova aktivnost drastično zmanjšuje s starostjo.Ж Delovanje FEN1 proteina.Zaradi slabše zanesljivosti delovanja polimeraz na mestih, kjer je veriga nukleotidov še kratka, je tam možnost napak večja. FEN1 skupaj z zadnjim ribonukleotidom odcepi tudi del prejšnjega Okazakijevega fragmenta, ki ga mora polimeraza nato ponovno izgraditi in s tem se možnost napake zmanjša.Ж Delovanje polimeraze DNA.

36.6. Inhibitorji podvajanja DNA.Poznamo tri načine delovanja inhibitorjev podvajanja DNA: Ustavitev podaljšanja Interakcija z molekulo DNA Vpliv na nukleotide

4


36.7. Razlike v podvajanju med prokarionti in evkarionti.

37. Popravljanje DNA

37.1. Dejavniki, ki povzročajo napake in poškodbe na DNA.Napake med replikacijo so redke, zato pa v DNA molekuli vsakodnevno prihaja do spontanih dogodkov, ki vodijo do napak v njeni strukturi:Ж Deaminacija (100/genom/dan)Do nje pride zaradi spontane hidrolize amino skupine baze (nastane amoniak), zaradi HSO3

- ali po reakciji z nitrili. citozin uracil, najpogostejša oblika deaminacije 5-metilcitozin timinMetilacija vpliva na izražanje gena. Adenin hipoksantin (vezi tvori s citozinom) Gvanin ksantin

Negativen vpliv na celico je posledica vezave spremenjeni bazi odgovarjajočega komplementa pri prihodnjem podvajanju, s čimer bo prišlo do zamenjave baznega para. Tako bomo namesto GC para dobili AT, ali pa GC namesto AT.Ж Depurinacija (104 purinov/dan/celico) Povzroči poškodbo, ki spominja na manjkajoče zobe. N-glikozidna vez med deoksiribozo in bazo se prekine, nastaneta prosta baza in riboza, ki dobi nazaj svojo OH skupino. Dobimo AP (abazna mesta). Posledica je delecija ali substitucija nukleotidnega para v eni od nastalih verig pri prihodnjem podvajanju.Ta mesta so zelo citotoksična:

povečajo inhibicijo topoizomeraz I riboza se linearizira nastane reaktivna aldehidna skupina

Ж Metilacijo povzročajo karcinogeni agensi in za njen potek so nujni prenašalci metilnih skupin. Tudi tu problem nastopi pri prihodnji podvojitvi, ko pride do zamenjave bp.

5


Ж Timinski dimeri močno prizadenejo strukturo DNA molekule; pod vplivom UV svetlobe se sosednja timina iz iste verige povežeta in tvorita dimer (ciklobutanski obroč).

37.2. Mehanizmi popravljanja napak na DNA.

♪ Demetilacija je zelo drag proces, ker posamezen encim katalizira samo eno reakcijo demetilacije in ko se le ta zaključi, se encim deaktivira in razgradi.

♪ Fotoreaktivacija je proces fotolize DNA, ki omogoča popravilo timinskih dimerov, za ločitev timina pa potrebuje en foton modre svetlobe.

♪ Izrezovanje je energetsko zahteven proces, ki poteka v večih stopnjah:

1. prepoznava okvare2. odstranitev napake tako, da se izreže del novo nastale verige3. zapolnitev vrzeli z uporabo genetske informacije komplementarne verige4. ligacija prekinjene verige

Popravljanje z izrezovanjem baz (BER- base excision repair) se uporablja za popravilo metilirane, deaminirane ali oksidirane baze in za popravilo AP mest.Prokarionti:

Glikozilaza DNA, ki je specifična za vrsto poškodbe, odcepi metilirano bazo tako, da dobimo AP mesto. Fosfodiesterska vez pred AP mestom se cepi s pomočjo endonukleaze AP. DNA polimeraza I s svojo eksonukleazno aktivnostjo 5' proti 3' odcepil nekaj nukleotidov skupaj z riboznim ostankom AP mesta. Poteče sinteza novega dela verige. Ligaza vzpostavi zadnjo fosfodiestersko vez in zakrpa prelom.

Pri evkariontih je dogajanje zelo podobno, le da sodelujejo drugi encimi. Tako pri procesu sodelujejo polimeraza δ ali ε, PCNA in FEN1. Slednji je specifična endonukleaza, ki odrine krajši del nukleotidne verige in omogoči njegovo ponovno izgradnjo.

Z izrezovanjem nukleotidov (NER- nucleotide excision repair) se popravijo večji addukti (npr. cisplatin ali BaP), pirimidinski dimeri in druge spremembe, ki povzročijo spremembo v strukturi heliksa.

6


Pri E. colli: Kompleks iz 4 proteinov se veže na DNA in jo 'skenira' do mesta tvorbe dimera. A proteini v kompleksu prepoznajo mesto dimera. B proteini odmaknejo verigi na mestu napake in nastane mehurček. A proteini oddisocirajo. D proteini, ki imajo tudi helikazno aktivnost, s svojo endonukleazno aktivnostjo cepijo okoli 15 nukleotidov za ali pred dimerom. Polimeraza I ali II zapolni vrzel in ligaza ponovno zlepi verigi.

V evkariontih pri enakem procesu sodeluje vsaj 25 proteinov z različnimi funkcijami. Edina razlika v mehanizmu je, da se odcepi košček dolg 25-35 nukleotidov. Poznamo bolezenska stanja pri katerih je ta proces okrnjen zaradi napak na genih, ki zapisujejo sodelujoče proteine. Okvarjenih je lahko tudi do 7 genov. Oboleli s to gensko boleznijo se morajo izogibati sončne svetlobe, saj morajo maksimalno zmanjšati možnost nastanka timinskih dimerov.

Pri E. colli je DNA veriga metilirana, kar pomeni, da ima na adenine dodano metilno skupino, saj se le metilirana veriga lahko pravilno prepiše v proteine. Takoj po zaključitvi podvajanja je molekula še hemimetilirana, ker metilaza DNA še ni imela časa, da bi dodala metilne skupine na novo verigo. Mismatch repair pri E. colli je mehanizem popravljanja napačno povezanih baz. Popravilo mora poteči hitro, dokler nova veriga DNA še ni metilirana.

MutS in MutL tvorita kompleks, ki se veže na mesto okvare. MutS mesto prepozna, MutL pa koordinira potek nadaljnjih procesov. MutH ima endonukleazno aktivnost in cepi novo verigo na 5' ali 3' koncu. Med novo in staro verigo loči na podlagi metilnih skupin, zato mora, zaradi orientacije, pričeti novo verigo cepiti v bližini mesta z metilno skupino na stari verigi in prenehati pri naslednji metilni skupini. Odrezani deli verige so lahko dolgi le nekaj ali pa 1000 nukleotidov. Takšni dolgi odseki so razlog, da se tvori zanka, pri vznožju katere se zberejo vsi encimi, ki pri procesu sodelujejo. Polimeraza izgradi novo verigo, zadnjo vrzel zapolni ligaza.

Pri evkariontih je postopek enak, le da še ni znano, kako encimi ločijo novo od stare verige.

37.3. Pomen popravljanja napak na DNA za organizem.Napake na DNA molekuli imajo lahko usodne posledice za organizem, če do njih pride v somatskih celicah, ali za njegove potomce, če do njih pride v spolnih celicah. Zato imajo vse telesne celice mehanizme za popravilo okvarjene DNA.Popravljanje napak je vitalno zaradi ohranjanja integritete genoma in njegovega normalnega delovanja ter posledično normalnega delovanja organizma.

37.4. Okvare encimov, povezanih s popravljanjem napak na DNA.Če se encim, ki je zadolžen za popravljanje napak na DNA, ni zmožen popraviti, lahko pride do zapisa za nefunkcionali protein – protein se ne prepiše, ne prevede ali ne opravlja svoje naloge v celici. Delovanje proteina je lahko zmanjšano ali pospešeno, kar ima lahko usodne posledice. Lahko pa, kljub napaki na DNA, protein ohrani nespremenjeno delovanje - silent mutation.

7


38. Sinteza RNA

38.1. Značilnosti molekul RNA in njihova vloga pri prenosu genske informacije.

Podobnosti med podvajanjem DNA in sintezo RNA: Proces poteka od 5' proti 3' koncu. Matrica DNA je nujna. Encimi so procesivni. Novo sintetizirane nukleinske verige so komplementarne in antiparalelne matrici. Procesa zajemata začetek (iniciacija), podaljševanje (elongacija) in zaključek (terminacija). Splošna reakcija polimerizacije:

Razlike med podvajanjem DNA in sintezo RNA: Kot matrica služi le ena od verig DNA. RNA se prepisuje le iz določenih področij na molekuli DNA. Primarni prepisi imajo na 5' koncu vezan 3-fosfat. Pomembna je promotorska regija, ki pove, kje se bo transkripcija začela, kajti če bi celica porabljala energijo za izgrajevanje snovi, ki jih ne potrebuje, bi propadla. Ni začetnega oligonukleotida. Encimi nimajo eksonukleazne aktivnosti, zato popravil napak ni. Napačno prepisana molekula RNA se razgradi še pred prepisom v protein.

38.2. Značilnosti nukleotidnih zaporedij prokariontskih in evkariontskih DNA, ki omogočajo sintezo RNA.

Potek osnovne transkripcije (ne zavrte ali pospešene) omogoča promotorska regija, bolj ali manj ohranjeno področje zaporedja nukleotidov. Od ohranjenosti je odvisna afiniteta polimeraze RNA za DNA verigo in s tem učinkovitost iniciacije prepisa.Pri evkariontih je promotor TATA zaporedje, ki je pri

mnogih genih nujen za učinkovito prepisovanje, medtem ko pri drugih določa le pravilno mesto iniciacije. Poleg promotorskih regij poznamo tudi zaporedja, na katere se vežejo aktivatorji. To so regije, ki sledijo osnovnemu promotorju, vendar so od njega lahko oddaljene tudi 1000bp (-1000).

8


38.3. Lastnosti prokariontskih in evkariontskih RNA- polimeraz.Prokarionti imajo eno samo vrsto polimeraze RNA, medtem ko imajo evkarionti kar tri različne, ki pa imajo še vedno določene skupne komponente.

38.4.

38.4.

38.4.

38.4.

38.4. Stopnje v sintezi RNA.Prokarionti:

a) Iniciacija Polimeraza RNA ima največjo afiniteto do dvoverižne DNA, kjer se veže na ohranjena področja. Ko se polimeraza veže na DNA, dobimo zaprt kompleks. Ko se veriga med -10 in +1 odpre, dobimo odprt kompleks. Prične se transkripcija. Pri dolžini okoli 25 nukleotidov je promotorska regija ponovno prosta in δ podenota se odcepi. Imamo RNA-DNA dupleks. Začne se druga faza,

b) Elongacija Tudi pri transkripciji sodelujejo topoizomeraze, ki skrbijo za reševanje topoloških problemov pri odvijanju verig.

c) TerminacijaPoznamo dve vrsti terminacije, ρ (rho) odvisno in ρ neodvisno. Pri Rho odvisni terminaciji sodeluje protein z RNA-DNA helikazno aktivnostjo. Protein se na C bogatem področju prične gibati po sintetizirani RNA molekuli, za kar porablja energijo ATP. Ko se polimeraza za trenutek ustavi, jo protein dohiti. Zdaj protein odrine encim od verige in sinteza se ustavi. Pri Rho neodvisni terminaciji se sinteza ustavi sama, zaradi ključnega zaporedja na matrici DNA. RNA se prepiše in je običajno palindrom (enako se bere z obeh strani). Najprej se sintetizira GC bogato področje, ki se uredi v obliko lasnice. Temu sledi AU področje, kjer se sinteza ustavi, ker so prisotne same šibke povezave in je polimeraza odrinjena.

Evkarionti:Pri transkripciji sodeluje veliko več proteinov. Ogledali si bomo primer sinteze mRNA, kjer je potrebna polimeraza II. Poznamo TBP (TATA binding protein), številne splošne transkripcijske (TF) in elongacijske (EF) faktorje. TFII A (B,E,F in H) skrbijo za prepoznavo promotorske regije in se vežejo med seboj ter z RNA polimerazo II. Nekateri imajo tudi helikazne aktivnosti, tako kot TFII H, ki ima tudi kinazno aktivnost in omogoča interakcije z nekaterimi proteinskimi kompleksi, ki sodelujejo pri posttranslacijskih modifikacijah.

Sprva se sestavi kompleks iz splošnih transkripcijskih faktorjev, ker polimeraza sama ni sposobna prepoznave promotorske regije. Zapovrstjo se vežejo TBP, TFII A, TFII F, TFII E in TFII H. Nastane zaprt kompleks. DNA se odvije in dobimo odprt kompleks. Polimeraza ima na C domeni več kot 50 ponovitev zaporedja 7 AK: tirozin-serin-prolin-treonin-serin-prolin-serin. Fosforilacija nekaterih od teh AK, ki jo omogoči TFII H, povzroči konformacijske spremembe, ki omogočijo začetek transkripcije. Pritegne pa tudi nekatere proteine, ki sodelujejo pri posttranslacijskih

modifikacijah. Ko se kompleks odmakne od promotorja, se nanj že veže naslednji. Odcepita se TFII E in H. Vežejo se elongacijski faktorji, ki povečajo hitrost transkripcije in zmanjšajo možnost ustavitve polimeraze tako, da dodatno fosforilirajo C konec. S tem se tudi

9


poveča možnost interakcij s kompleksi, ki sodelujejo pri posttranskripcijskih modifikacijah. Poteče faza elongacije. Po koncu transkripcije se polimeraza odcepi in defosforilira. Natančen mehanizem terminacije ni znan.

Polimeraza I in III za sestavljanje potrebujeta drugačne proteine. I tako potrebuje UAF, H3, H4, TBP, CF in Rrn3p, III pa TFIII. Zanimivo pri slednji je, da se promotor nahaja na mestu, ki se tekom transkripcije prepiše.

Acetiliranje lizinskih ostankov v histonskih nukleosomihNeaktiven heterokromatin se mora, če želi na njem poteči transkripcija, spremeniti v evkromatin. To doseže z demetilacijo promotorjev in acetiliranjem lizinskih ostankov na histonih 3 in 4. Če se promotor metilira, se nanj vežejo proteini, ki ga zakrijejo in transkripcija se ustavi, medtem ko demetiliran promotor veže transkripcijske faktorje. Acetilirani histoni rezultirajo v bolj odviti DNA molekuli. Donor acetilne skupine je acetil-CoA.

38.5. Inhibitorji sinteze RNA pri evkariontih in prokariontih ter raven njihovega delovanja.

10


39. Posttranskripcijska dodelava RNAPosttranskripcijska dodelava RNA večinoma poteka vzporedno s transkripcijo. Kotranskripcijsko oz. posttranskripcijsko molekula mRNA dobi:

kapo na 5' koncu izrežejo se introni na 3' konec se doda poli A rep

39.1. Mehanizmi izrezovanja intronov iz primarnih prepisov mRNA pri evkariontih.

Vse RNA molekule imajo v svojem primarnem prepisu prisotne introne, vendar večinoma govorimo o njih pri mRNA. Introni so različno dolga nukleotidna zaporedja, za katere je do nedavnega veljalo, da ne zapisujejo ničesar in so t.i. 'junk'. Njihova dolžina se z razvitostjo organizma povečuje. Pri človeku je dolžina eksona pod 1000 bp, dolžina introna pa do približno 20000 bp. Danes vemo, da introni nosijo zapise za nekatere male RNA molekule in imajo v celici pomembno funkcijo. To je razumljivo, saj je transkripcija zelo drag proces in celice ne bi po nepotrebnem prepisovale tako velikih odsekov DNA.Introne delimo v dve večji skupini:♪ Samoizrezovalne introne, ki za izrezovanje in povezavo eksonov ne potrebujejo

energije.♪ Introne, ki za izrez potrebujejo izrezovalno-povezovalni kompleks (spliceosome).

I skupina: introni v mitohondrijskih in kloroplastnih genih nižjih organizmovJe skupina samoizrezovalnih intronov, katerih osnovni proces izrezovanja je

transesterifikacija. Kot nuklefili sodelujejo GMP, GDP ali GTP. V procesu se cepijo fosfodiesterske vezi.Nukleofil- ion ali molekula s prostim parom elektronov, ki ga lahko da na razpolago za tvorbo veziII skupina: introni v mitohondrijskih in kloroplastnih genih gliv, alg ter rastlinPri obeh skupinah se vedno najprej odcepi 5' konec introna in šele nato 3' konec.

Izrezovalno-povezovalni kompleks je zgrajen iz okoli 150 proteinov in malih jedrnih RNA (snRNA) (U1,U2,U4,U5 in U6- U3 ne obstaja, saj se je kasneje izkazalo, da domneven U3 ni mala jedrna RNA). Naloga tega kompleksa ribonukleoproteinov je zaznava začetka in konca introna, njegov izrez ter povezava eksonov. Za potek procesa je nujna energija, ki jo organizem dobi s hidrolizo ATP. Le ta se porabi za sestavo neaktivnega kompleksa in za njegovo konformacijsko spremembo ter s tem prehod v aktiviran kompleks.

11


Introni imajo 4 značilna (signalna) zaporedja, kamor se vežejo deli spliceosoma. 3' mesto izrezovanja in povezovanja, na 3' koncu introna, je zgrajeno predvsem iz AG zaporedja, 5' mesto izrezovanja in povezovanja, na 5' koncu introna oz. 3' koncu

prvega eksona, pa iz GU zaporedja. U1 se veže na mejo med eksonom1 in intronom, U2 pa prepozna razvejitveno mesto, ki sodeluje pri prvi reakciji transesterifikacije med nastankom intronske zanke. Ravno U2 je indikator, da se je ta skupina intronov razvila iz II skupine, saj vsebuje adenin, katerega OH skupina deluje kot nukleofil. Četrto signalno mesto je pirimidinsko zaporedje. Poleg teh zaporedij so za vezavo spliceosoma pomembni še regulatorni proteini, ki se vežejo na ekson in olajšajo vezavo snRNA ter tako pospešijo izrezovanje. Po poteku dveh transesterifikacij, se zanka odcepi in eksona sta zlepljena.Proces poteka kotranskripcijsko, na fosforilirano C območje polimeraze se veže spliceosom, ki nato opravi svojo nalogo.

39.2. Dodelava na koncih evkariontskih mRNA in njihov pomen.Na 5' konec mRNA se med transkripcijo doda kapa. Le ta je pomembna pri pravilni namestitvi mRNA na ribosom med translacijo in služi za zaščito pred 5'-3' eksonukleazno aktivnostjo.

12


Ko je veriga mRNA dolga 30-40 nukleotidov se na fosforilirani C konec polimeraze veže encimski kompleks. Kompleks izgradi kapo, nato se odcepi in napravi mesto za drugi kompleks, ki poskrbi, da kapa ostane vezana na C konec verige. Kapa je ves čas transkripcije v interakciji s polimerazo.

Na 3' konec mRNA se posttranskripcijsko doda poli A rep, ki pri evkariontih zaščiti molekulo pred 3' proti 5' razgradnjo. Pri prokariontih poli A rep povzroča nestabilnost molekule. Primarni prepis mRNA je daljši, saj se DNA prepiše dalj, kot le do mesta, kamor se doda rep. Mesto dodajanja repa spredaj in zadaj obdajajo specifična nukleotidna zaporedja, ki označujejo mesto cepitve. Na ta zaporedja se vežejo specifični proteini, od katerih imajo nekateri encimsko delovanje. Endonukleaza cepi verigo na mestu dodajanja repa, poliadenilat polimeraza pa doda prvih 10 adeninov. Na te adenine se vežejo proteini, ki stimulirajo poliadenilat polimerazo, da izgradi še približno 10 adeninov ter tako dokonča poli A rep. Za reakcijo je potrebna energija.Poliadenilat polimeraza je sposobna vezave AMP brez podlage, saj ji mRNA predstavlja začetni oligonukleotid. Reakcija, ki jo katalizira se glasi:

13


Poli A rep se med translacijo krajša, ker takrat nanj niso vezani zaščitni proteini. Zato, več translacij opravi mRNA, krajši ima rep. Sčasoma je dosežena kritična dolžina repa in mRNA počasi razpade.

39.3. Dodelava primarnih prepisov rRNA.Prokarionti:Primarni prepis rRNA je okoli 6500 bp velika molekula, ki nosi zapise za rRNA in tRNA. Pri E. coli poznamo 7 različnih molekul, ki nosijo identične zapise rRNA, vendar se razlikujejo tako v številu, kot v sami sestavi zapisa za tRNA. Na molekuli so zapisi treh rRNA: 16S, 23S in 5S. V teku posttranslacijskih modifikacij poteče v področju 16S in 23S metilacija sladkorjev, kar ostane prisotno tudi pri zrelih molekulah rRNA.Ta velik zapis nato RNaze (III, P (ribocim) in E) cepijo na mejah med različnimi zapisi. Poleg RNA molekul nastajajo tudi vmesna področja, ki niso introni, saj so kratka in v celici nimajo nobene funkcije. Po prvih cepitvah nastanejo intermediati, ki jih nukleaze spremenijo v zrele molekule. To naredijo tako, da s končkov odstranijo še zadnje delce vmesnih področij.

Evkarionti:♦ V skupni 45S molekuli pre-rRNA niso

prisotni zapisi za tRNA molekule, ampak samo zapisi za 18S, 5,8S in 28S rRNA.

♦ Metilacija poteče na celotni molekuli, na OH skupinah drugega mesta riboze.

♦ Pri cepitvah sodelujejo kompleksi proteinov in snRNA, se pravi ribocimi.

39.4. Dodelava primarnih prepisov tRNA. (tRNAtyr pri kvasovki)

Geni, ki zapisujejo tRNA so krajši in nanizani eden za drugim, zato se 40-50 molekul tRNA prepiše na isto molekulo, pre-tRNA. Pri tej molekuli sta 5' in 3' konec daljša kot v zreli molekuli. 3' konec cepi eksonukleaza RNazaD, medtem ko 5' konec cepi ribonukleoprotein endonukleaza RNazaP.Ob cepitvi poteče tudi modifikacija baz, predvsem dodajanje CCA zaporedja na 3' konec. To opravi nukleotidil transferaza, ki ima tri aktivna mesta, dva za CTP in enega za ATP. Na ta način vedno doda isto nukleotidno zaporedje. CCA zaporedja so mesto vezave AK in njihove aktivacije.Pogosto so v zanki prisotni tudi introni, ki jih izreže citosolni encimski kompleks. Kompleks sestavljajo ligaza, endonukleaza in ATP. tRNA introni v zanki so edini introni, za izrez katerih je potrebna energija.

Pri evkariontih je na eni molekuli pre-tRNA zapis le za dve zreli molekuli.

14


40. Sinteza proteinov

40.1. Značilnosti genetskega koda.V genetskem kodu 3 nukleotidi predstavljajo en kodon in nosijo zapis za eno aminokislino. V telesu imamo 64 različnih kodonov, med katerimi so štirje posebni:

UAA, UAG in UGA so STOP kodoni AUG je začetni kodon, ki nosi zapis za metionin

Genetski kod je degenerativen, kar pomeni, da več različnih kodonov specificira isto aminokislino. Najpogosteje se takšni kodoni med seboj razlikujejo zgolj v 3. bazi (gledano 5' proti 3' koncu). Izjemoma se pojavijo tudi razlike v prvem oz. drugem nukleotidu, kot je primer pri argininu. Genetski kod je tudi skoraj univerzalen. Gledano s strani citoplazemske evkariontske in prokariontske mRNA je kod univerzalen, kar pomeni, da isti kodon pri vseh organizmih zapisuje isto AK. Vendar se odstopanja pojavijo pri mRNA, ki nastane v kloroplastih in mitohondrijih.

O odprtem bralnem okvirju govorimo, kadar fragment DNA vsebuje vsaj 50 zaporednih kodonov, ki ne vsebujejo STOP kodona. V primeru pogostih STOP kodonov ne moremo govoriti o odprtem bralnem okvirju.

40.2. Aktivacija aminokislin in pomen natančnosti tega procesa.Transportna RNA vsebuje 4 področja ali ročice. Aminoacidna in antikodonska ročica imata adaptersko vlogo, njun namen je prevod zapisa 3 nukleotidov v aminokislino. D in T ročica omogočata 3D sestavo molekule. Pri nekaterih molekulah lahko najdemo še dodatne ročice.

Antikodon je zaporedje 3 nukleotidov, ki so vsaj v dveh bazah komplementarni kodonu. Povezava med kodonom in antikodonom omogoča antiparalelno povezavo med mRNA in tRNA.

Mesto 1 in 2 kodona se z antikodonom poveže po principu komplementarnosti, mesto 1 antikodona pa določa število mRNA s katerimi se tRNA lahko poveže:

U in G se lahko povežeta z dvema različnima nukleotidoma (U z A ali G in G s C ali U)

inozinat se lahko veže na tri različne nukleotide A,U ali CTa dva načina povezave sta šibkejša.

C in A se povezujeta samo po načelu komplementarnosti in zato tvorita močne povezave.

Takšni načini vezave organizmu omogočajo nemotene procese z manj kot 61 (število kodonov brez STOP kodonov) različnimi tRNA. Vsak organizem ima najmanj 32 različnih tRNA. Šibkejše vezi omogočajo tudi lažjo disociacijo molekule tRNA z mRNA in s tem hitrejšo translacijo.

15


Prva stopnja v poteku sinteze proteina je aktivacija aminokislin, to je proces vezave AK na tRNA. Reakcija poteče v dveh stopnjah:Najprej se COOH AK poveže z α-fosfatom na ATP molekuli z anhidridno vezjo. Pri tem se odcepi pirofosfat. Nato se aminokislinski ostanek veže na 3' mesto riboze tRNA z estersko vezjo. Dobimo aminoacil-tRNA.Pri procesu sodelujejo encimi sintetaze, ki jih glede na njihovo delovanje razdelimo v dva razreda. Nekatere AK ostanek takoj dodajo na 3' mesto, medtem, ko ga druge prvo povežejo z 2' mestom riboze. V slednjem primeru sledi transesterifikacija in AK ostanek se prav tako na koncu znajde na 3' mestu. Vsaka sintetaza je specifična za določeno AK.

Reakcija aktivacije AK se glasi:

Tako kot za vsako reakcijo, pri kateri nastane PPi, je tudi za to potrebna energija dveh ATP.

Pomen aktivacije je predvsem v tem, da je to edini mehanizem, ki nadzoruje vezavo pravilne AK na določeno tRNA. Ko se aktivacija zaključi, drugega mehanizma za prepoznavo napake ni. Aminoacil-tRNA sintetaze na več ravneh zagotavljajo pravilnost povezave:

Sintetaze so specifične za določeno AK in aktivno mesto mora prepoznati AK. Ker so si nekatere AK med seboj zelo podobne, ima encim tudi to možnost, da

prekine anhidridno vez z AK, če ugotovi, da je vezana napačna. Encimi imajo sposobnost prepoznave aminoacil-tRNA z napačno vezano AK. V tem

primeru cepijo estrsko vez, za kar je potreben ATP. Kljub temu nosi tRNA še vedno ključno vlogo pri razpoznavanju pravilne AK.

40.3. Komponente, vključene v začetek sinteze proteinov.Ribosomi so veliki kompleksi iz 2 podenot, zgrajeni iz rRNA in proteinov, ki jih najdemo tako v evkariontih kot v prokariontih. Funkcionalna enota ribosomov so RNA molekule, medtem ko proteini služijo le zaščiti. Pri prokariontih jih najdemo povsod, kjer poteka translacija, to je v citoplazmi, v kloroplastih in v mitohondrijih. Njihovo število je odvisno od aktivnosti celice, npr. v E. colli predstavljajo kar četrtino suhe teže celice.

Iniciacija pri prokariontih:Začetek iniciacije omogočajo citoplazemski proteini imenovani iniciacijski faktorji: ♪ IF-3 prepreči združitev obeh podenot ribosoma in na ta način zagotovi, da se bo

mRNA vezala na peptidno (P) mesto male podenote. ♪ IF-1 prepreči vezavo AK na aminoacilno (A) mesto.

S purini bogato zaporedje mRNA se veže na s pirimidini bogato področje na 16S rRNA. AUG zaporedje molekule se veže na malo podenoto in sicer na peptidno mesto. Tako se prične tvoriti iniciacijski kompleks.Prva se veže tRNA, ki nosi formil metionin. Na tem mestu vidimo, da mora imeti vsaka celica dve različni molekuli tRNA za prenos metionina. Ena je potrebna za prenos prvega metionina, ki označuje začetek sinteze

16


proteina, druga pa za vse metionine, ki so vgrajeni na drugih mestih v proteinu. Poleg tega je razlika tudi v mestu vezave tRNA s formil metioninom in vseh ostalih tRNA.

♪ Nazadnje se veže IF-2 z vezanim GTP. Poteče hidroliza GTP molekule, vsi IF se odcepijo in dobimo funkcionalen ribosom iz dveh podenot, z vezano mRNA in tRNA.

Iniciacija pri evkariontih:Pri iniciaciji translacije pri evkariontih sodeluje veliko več IF. Prvi se veže na peptidno mesto in pospeši sestavljanje kompleksa, medtem ko drugi s helikazno aktivnostjo razbije vse morebitne sekundarne strukture mRNA. Nekateri IF se vežejo direktno na molekulo RNA in vstopijo v interakcijo s kapo in poli A repom. Zaradi slednjih morata biti oba konca molekule v brezhibnem stanju, sicer translacija ne more poteči. IF v evkariontih pravzaprav pregledujejo tisti del mRNA, ki se ne prepiše, do začetnega AUG mesta. Bistvo tega procesa je, da je začetni del molekule mRNA zaseden in se ne more vezati na ribosom. Tako je poskrbljeno, da se AUG zaporedje pravilno veže na peptidno mesto.

40.4. Sinteza proteinov, ki se prenesejo iz citosola na končno mesto.ElongacijaSamo prva aminoacilna molekula tRNA se veže na P mesto, vse nadaljnje se vežejo na A mesto. Energijo za vezavo vsake naslednje molekule tRNA da EF-Tu, ki ima vezan GTP. Ko poteče hidroliza GTP, EF-Tu oddisocira in se v citosolu regenerira. Energija zagotavlja hitrost in natančnost procesa. Pri prokariontih je možnost napake 1/ 10000 AK.Molekula tRNA se veže na A mesto in peptidil transferaza, ribocim 23S rRNA, med AK ostanki napravi peptidno vez. Za tvorbo vezi je potrebna energija 1 GTP, ki jo

priskrbi EF-G. tRNA na P mestu ostane brez AK ostanka, medtem ko tRNA na A mestu postane diacil. Zaradi konformacijskih sprememb, ki jih je proces povzročil sta 5' in 3' konec zamaknjena. (česa?!)Pride do procesa translokacije, ko prazna tRNA zapusti ribosom skozi E (exit) mesto, diacil se premakne z A na P mesto in nova molekula aminoacil-tRNA se veže na A mesto.Energijo za ta premik ribosoma, ki pomeni konformacijsko spremembo, ponovno zagotovi EF-Tu, ki ima vezano eno molekulo GTP.Za vsako naslednjo dodano AK se postopek ponovi.

17


V procesu terminacije je ključnega pomena cepitev esterske vezi med polipeptidom in tRNA. Pri tem pomagajo trije terminacijski faktorji, ki so po strukturi zelo podobni molekulam aminoacil-tRNA, RF-1, RF-2 in RF-3. Ko pride v ribosom STOP kodon, ga prepozna RF-1 ali RF-2, odvisno od tega, za kateri kodon gre, in sporočilo predata RF-3, ki ob porabi ene molekule ATP omogoči konformacijske spremembe na ribosomu, ki omogočijo vsem komponentam da oddisociirajo. Komponente so obe podenoti ribosoma, tRNA, mRNA in peptid.Pri evkariontih je edina razlika v tem, da imamo namesto treh samo dva faktorja. RF-1 v evkariontih namreč sam prepozna vse tri STOP kodone. Preostali mehanizem delovanja je identičen.

Sinteza poteka hitreje pri prokariontih, ker transkripcija in translacija nista prostorsko ločeni, obe potekata v citosolu. Medtem, ko se mRNA še vedno sintetizira, na njenem sintetiziranem koncu že poteka translacija. V evkariontih mora prvo poteči transkripcija v jedru, nato se že končana mRNA prenese v citosol, kjer šele poteka translacija.

Zaradi časovne potratnosti se nikoli ne zgodi, da bi na eni molekuli mRNA potekala translacija samo na enem ribosomu. Vedno govorimo o polisomih, kar pomeni, da je na isto molekulo mRNA nanizanih več ribosomov. Takoj, ko konec molekule mRNA pogleda iz ribosoma, se nanj že veže naslednji.

18


40.5. Inhibitorji sinteze proteinov pri prokariontih in raven njihovega delovanja.

40.6. Inhibitorji sinteze proteinov pri evkariontih in raven njihovega delovanja.

41. Postsintetska dodelava proteinovVečina proteinov v našem telesu je zgrajenih iz več kot 100 različnih AK. Večina tistih, ki ne sodijo med 20 glavnih AK, nastane z modifikacijami, ki potekajo v ER in GA.

Proteini, ki se morajo usmeriti iz citosola v ER, imajo signalno sekvenco. Le te se med seboj razlikujejo glede na protein na katerem se nahajajo, vendar imajo tudi nekatere skupne značilnosti:§ hidrofobna regija§ blizu mesta cepitve se nahajajo AK s krajšimi

stranskimi verigami§ na N koncu imajo 1 ali več nabitih AK

Signalna sekvenca vstopi v interakcijo s signalnimi delci, ribonukleotidi, na ribosomu. Ribosom se približa

citosolni strani ER, kjer receptor spozna signalno sekvenco. Ob dodatku energije z molekulo GTP, se ribosom poveže z drugim receptorjem. Nastajajoč peptid se translocira v ER, kjer lahko potečejo številne posttranslacijske in kotranslacijske modifikacije.

19


41.1. Glikozilacije in njihov pomen.Glikozilacija poteka v ER in delno v GA. Pomembna je predvsem za membranske in signalne proteine, saj omogoča povezave med celicami, interakcije in izmenjavo informacij. Poleg tega spremeni topnost molekule in jo stabilizira. Poznamo O in N glikozilacijo. Razlike med njima:

pri N glikozilaciji se sladkor veže na asparagin pri O glikozilaciji se sladkor veže na serin ali treonin N vedno poteka kotranslacijsko O skoraj vedno poteka posttranslacijsko

Za proces so potrebni številni specifični encimi:♪ za monosaharid, ki se doda♪ glede na strukturo in zaporedje akceptorske molekule♪ glede na oligosaharid (glikozil transferaze, so specifične za sladkor, ki se je

vezal zadnji)♪ glede na mesto in konfiguracija vezi, ki nastane (α in β vezi, 1—»4, 1—»3,…)

Glikozilacije v različnih celicah so različne, ker vse celice ne vsebujejo enakih glikozil transferaz. Več različnih glikozil transferaz je v celici, bolj je lahko kompleksen nastali sladkorni del. Tudi intenziteta glikozilacije se od celice do celice razlikuje.

V procesu glikozilacije se lahko dodajajo različni sladkorji, vendar morajo biti v aktivni obliki. Sladkorji se ne vežejo direktno na encime, ampak na donorske molekule. To sta UDP in GDP.

V membrani ER se nahaja molekula dolihol. Ko se fosforilira, se na nastali dolihol fosfat prično dodajati sladkorji. Sladkorji sprva gledajo v citosol, med procesom pa pride do translokacije in sladkorji se obrnejo v lumen ER. V lumnu se sladkorji dodajajo še naprej, dokler se ne izgradi končen oligosaharid, ki se prenese na asparagin nastajajočega proteina. Glikozilacija se konča, ko akceptorska molekula sladkorja ni več substrat za glikozil transferazo.

V GA potekajo večinoma O glikozilacije. Ker mora protein iz ER po končani translaciji, ko ga šaperoni že zvijejo v funkcionalno strukturo, pripotovati v GA, so to posttranslacijske modifikacije. Glikozilacija zato lahko poteče samo na izpostavljenih AK ostankih, do katerih ima encim prost dostop. V GA lahko s pomočjo glikozidaz poteče tudi cepljenje sladkorjev.Ko so modifikacije v GA končane, gre lahko protein na svoje delovno mesto.

20


41.2. Najpogostejše modifikacije aminokislinskih ostankov in njihov pomen.§ glikozilacija (glej zgoraj)§ tvorba disulfidnih vezi z disulfidnimi izomerazami ---» poveča stabilnost molekule

41.3. Postsintetska dodelava kolagena in njen pomen.Kolagen je zgrajen iz treh polipeptidov α1, α2 in α3, ki jih zapisujejo različni geni na različnih kromosomih. Vsaka α veriga je zgrajena iz 1000 AK. Skozi celo dolžino verige se pojavljajo ponavljajoča zaporedja: Gly - X – Y. X je v tretjini primerov prolin, Y je hidroksiprolin ali hidroksilizin. Slednji AK nastaneta s ko- in posttranslacijskimi modifikacijami. Za njun nastanek poskrbijo lizil-hidroksilaza, prolil-4-hidroksilaza in prolil-3-hidroksilaza. Vsi trije encimi za svoje delovanje nujno potrebujejo Fe2+ in askorbinsko kislino.Reakcija:

Hidroksilacija prolina molekuli zagotovi stabilnost, hidroksilacija lizina pa medverižne povezave.Sočasno s sintezo na ER potekajo hidroksilacije in O glikozilacije. Ko se sinteza in kotranslacijske modifikacije končajo, se na C konec veže globularna struktura, ki je stabilizirana z disulfidnimi vezmi. Kot posledica nastane α-heliks in tudi N konec dobi globularno enoto ojačeno z disulfidnimi vezmi. Zdaj se molekula transportira v GA, kjer pride do cepitve nekaterih sladkorjev in ponovne glikozilacije. GA zapusti v obliki vezikla in se izloči v ECM. V ekstracelularni fazi se globularni enoti odcepita z endopeptidazo. Molekula je pripravljena na povezavo v kolagenska vlakna.

MODIFIKACIJE IN NASTANEK PRAVEGA INZULINAOb sintezi je molekula preproinzulina zgrajena iz večih delov: signalnega zaporedja, β- verige, povezovalne C verige in α- verige. V prvi fazi peptidaza odcepi signalno verigo in v drugi fazi disulfidne izomeraze tvorijo disulfidne vezi znotraj α- verige ter med α- verigo in β- verigo. Dobimo proinzulin.V tretji fazi, ki poteka v GA, endopeptidaza odcepi C verigo. Dobimo zrelo molekulo inzulina.

Pomen sinteze ene velike peptidne molekule, namesto več manjših, je zagotovitev enakega števila (ekvimolarne količine) α in β- verig. Povezovalna C veriga zagotovi pravilno strukturo molekule inzulina in povezavo cisteinov z disulfidnimi mostički.

42. Uravnavanje izražanja genov§ Nekateri proteini, kot je npr. aktin, so prisotni v vseh celicah. Zato genom, ki jih zapisujejo, pravimo hišni geni. Vendar se ti geni ne izražajo v vseh celicah enako, količina produktov je lahko večja ali manjša, o čemer odločajo promotorska področja in afiniteta TF ter polimeraz za vezavo nanje. Od afinitete je odvisna intenzivnost izražanja gena. Večja je afiniteta, večkrat se bo transkripcija pričela in več bo produkta. Uravnavanje genov je nujno, saj mora v celici vladati točno določeno razmerje med komponentami.§ Druga vrsta genov so uravnavani geni, katerih izražanje je nadzirano z aktivatorji in represorji.

42.1. Ravni uravnavanja izražanja genov.Ravni uravnavanja izražanja genov pri evkariontih:

na DNA (iniciacija sinteze mRNA)

21


posttranskripcijsko raven transporta mRNA iz jedra stabilnost molekule mRNA raven translacije (iniciacija sinteze proteina)

42.2. Mehanizmi negativnega uravnavanja izražanja genov.Negativno uravnavanje z represorji je značilno predvsem za prokarionte. Represorji uravnavajo pričetek iniciacije in delujejo po dveh principih, samostojno ali z vezanim korepresorjem. Bistvo je, da prepis ne more poteči, če so vezani na operatorsko regijo, ker takrat zakrijejo mesto vezave polimeraze (oz. TF) in iniciacija je onemogočena. Korepresor ali signal je molekula, ki lahko pride v celico iz ECM ali pa je v njej sintetizirana in konformacijsko spremeni represor ter mu s tem omogoči vezavo na DNA. Ko signal disocira, se represor vrne v prvotno stanje.

Primer: laktozni operon E.coliKo je v celici dovolj glukoze, se le ta veže na molekulo DNA kot represor za gen, ki zapisuje kar tri encime povezane z razgradnjo laktoze. Prvi je β-galaktozidaza, ki cepi laktozo v galaktozo in glukozo, drugi je permeaza, ki skrbi, da laktoza lahko vstopa v celico in tretji je transacetilaza. Slednji ima funkcijo, ki je le posredno povezana z laktozo, saj nekatere toksične galaktozide spreminja v netoksične, ki jih celica lahko izloča. Nizka koncentracija teh treh encimov se v celici nahaja tudi, ko je njihova sinteza onemogočena. Gre za zalogo celice, da lahko, ob pojavu laktoze v okolju, nekaj molekul transportira v celico. V celici se del laktoze razgradi, del pa se jo pretvori v alolaktozo. In ravno alolaktoza je signalna molekula, ki se veže na represor, glukozo, in na njej povzroči konformacijske spremembe, ki privedejo do njene disociacije in izražanja gena.

42.3. Mehanizmi pozitivnega uravnavanja izražanja genov.Pozitivno uravnavanje z aktivatorji je značilno predvsem za evkarionte. Aktivator je molekula, ki pospešuje vezavo iniciacijskega kompleksa in s tem izražanje gena, ko je vezana na molekulo DNA. Tudi ta deluje na dva načina. Pri prvem ima veliko afiniteto do vezave na molekulo DNA in transkripcija normalno poteka. Ko v celico prodre signal, ki se veže na aktivator, se le ta konformacijsko spremeni in njegova afiniteta do vezave pade. Transkripcija je ustavljena. Pri drugem načinu ima aktivator veliko afiniteto do vezave na DNA samo, če ima vezan signal. Če signal disocira se aktivator konformacijsko spremeni in izražanje gena se ustavi. Tudi v primeru pozitivnega uravnavanja genov velja, da se molekule vrnejo v prvotno stanje, če signal preneha delovati.

Primer: promotor LDL receptorja pri človekuHolesterol se po telesu k celicam prenaša v obliki LDL partiklov, ki preko receptorjev vstopajo v celico. Eden od načinov uravnavanja količine holesterola v celici je uravnavanje količine LDL receptorjev na membrani. Ko je holesterola dovolj, je SREBP (sterol response element binding protein) vezan v membrani ER skupaj s proteinom, ki zaznava koncentracijo holesterola v celici. Če koncentracija holesterola pade, se SREBP prenese v cis GA. Aktivirajo se proteaze, ki odcepijo terminalne dele proteina in mu omogočijo prehod v jedro. Aktiviran protein se veže na SRE1 (sterol response element) mesto na genu in prične se izgradnja preiniciacijskega kompleksa, ki signal od SRE1 mesta prenese do promotorja. Vežejo se acetilaze, nanje pa še nadaljnji proteini, dokler informacija ne doseže promotorja. Zdaj se prične gradnja iniciacijskega kompleksa in transkripcija.

22


42.4. Pomen pozitivnega uravnavanja izražanja genov pri evkariontih.V celici nič ni prepuščeno naključju in zato niso uravnavani le geni, temveč tudi snovi, ki uravnavajo njihovo izražanje:

♪ sintetizirajo se samo v specifičnih pogojih ali tkivih♪ specifičnost vezave je uravnavana s kofaktorji♪ regulatorji delujejo kot homo- ali heterodimeri♪ regulatorji imajo lahko posttranslacijske modifikacije (metilacija, cepitev končkov, ipd.)

Na ta način celica skrbi, da ima vedno na voljo snovi, ki jih potrebuje za opravljanje svoje funkcije in ne porablja energije za sintezo nepotrebnih celičnih komponent.

42.5. Vloga metilaz/demetilaz in acetilaz/deacetilaz pri uravnavanju izražanja evkariontskih genov.

Acetilacija: Da poteče transkripcija, mora biti DNA v razviti obliki- evkromatin. Za zvitost molekule skrbijo histoni, ki so bogati z lizinskimi ostanki. Če se ti ostanki acetilirajo, histoni popustijo zaradi zmanjšanih elektrostatskih privlakov in DNA se razvije. Transkripcija poteče. Ko se histoni ponovno deacetilirajo, dobimo heterokromatin in nastanek RNA molekul je onemogočen.Metilacija: Pri heterokromatinu so citozini v promotorju metilirani in nanje so vezani proteini, ki onemogočajo vezavo iniciacijskega kompleksa. Ko se 5' konec citozinov demetilira, se afiniteta proteinov do promotorja zmanjša in se odcepijo. Iniciacijski kompleks se lahko veže.

42.6. Vloga nukleotidnih zaporedij v promotorjih genov pri uravnavanju izražanja evkariontskih genov.

Transkripcija aktivnih genov je regulirana z uravnavanjem osnovnega transkripcijskega kompleksa, ki nadzira RNA polimerazo in njeno povezavo s TATA zaporedjem (TATA box) na promotorju. Povezavo tvorijo TBP in drugi proteini, ki jim rečemo osnovni transkripcijski faktorji. Ti proteini povišajo frekvenco transkripcije in so potrebni za delovanje promotorja. Kontrolna regija genov vsebuje tudi DNA regulatorno sekvenco (enhancer), ki je specifična za določen gen in lahko pospeši njegovo transkripcijo za več kot 1000x. Transaktivatorji (za gene specifični TF) se vežejo na enhancerje in hkrati interagirajo s koaktivatorji. S formacijo zanke v DNA lahko koaktivatorji interagirajo z osnovnim transkripcijskim kompleksom in aktivirajo sekvence na iniciacijski strani promotorja. Te DNA sekvence so lahko od promotorja tudi nekoliko oddaljene. Enhancersko zaporedje nukleotidov je od TATA zaporedja oddaljeno več 1000 nukleotidov, zaradi česar je za interakcijo med iniciacijsko stranjo promotorja in enhancerjem potrebna premestitvena struktura (zanka). Koaktivatorji skrbijo za povečanje transkripcije takrat, ko se na enhancer veže transaktivator. Na mesto koaktivatorja se lahko veže tudi represor. V tem primeru je koaktivator vezan, a se zaradi prisotnosti represorja ne more povezati s transaktivatorjem. Posledično ne pride do izražanja genov.

42.7. Vloga alternativnega izrezovanja intronov in alternativne izbire poliadenilacijskega signala pri izražanju evkariontskih genov.

Če en gen zapisuje dva različna proteina, se šele s posttranskripcijsko modifikacijo določi, kateri protein se bo izrazil. Pri enaki molekuli mRNA se lahko izrežejo različni introni ali pa se poli A rep doda na različna mesta v molekuli. V obeh primerih so nastale molekule med seboj različne. Zaradi alternativnega izrezovanja intronov je število genov, ki jih organizem potrebuje, manjše, kot bi bilo sicer. V povprečju en gen zapisuje tri proteine. Poleg tega omogoča veliko raznolikost in specifičnost vrst, kljub zelo majhnim razlikam v genih sesalcev. Kar ¼ alternativno izrezanih intronov je specifičnih za posamezno vrsto.

Primer je gen, ki se izraža tako v jetrih kot v tankem črevesu, vendar v vsakem organu zapisuje drugačen protein. V jetrih iz njega nastane ApoB-100, komponenta LDL partikla, medtem ko se v črevesju CAA zaporedje v sredini molekule deaminira in dobimo UAA zaporedje. To zaporedje zapisuje STOP kodon in

23


sinteza se ustavi veliko prej kot v jetrih. Produkt ni komponenta LDL partiklov, temveč komponenta hilomikronov. Drugi primer je gen za kalcitonin v parafolikularnih celicah ščitnice. Identičen gen v možganih zapisuje protein povezan z okušanjem hrane.

42.8. Primeri uravnavanja izražanja genov na ravni stabilnosti mRNA in na ravni proteinske sinteze.

RNA-interferenca (RNAi) je posttranskripcijski mehanizem razgradnje mRNA ali zaviranja translacije, s čimer se prepreči oz. zavre izražanje specifičnega gena. RNA molekule, ki sodelujejo pri procesu RNAi:

Dvoverižna RNA (double-stranded RNA, dsRNA) je eksogena molekula, ki sestoji iz dveh komplementarnih verig. Nahaja se v celični citoplazmi, kamor pride kot virusna ali umetno sintetizirana molekula. Ker iz nje celica dobi male interferenčne molekule RNA, predstavlja začetek v procesu RNA-interference. Mala interferenčna RNA (small interference RNA, siRNA) je majhna dvoverižna molekula iz 21 do 24 nukleotidov, ki nastane s cepitvijo dsRNA ali sintezo v jedru. Mikro RNA (micro RNA, miRNA) je po funkciji in velikosti zelo podobna molekuli siRNA, vendar izhaja iz intronov in je enoverižna.

Obe molekuli, tako miRNA kot siRNA, zavirata delovanje specifičnih genov v celici. Kljub temu za svoje delovanje uporabljata dva podobna, a še vedno različna mehanizma:Delovanje siRNA lahko razdelimo na dve fazi:V prvi fazi Dicer, RNaza III encim, prepozna in razreže eksogeno dsRNA na manjše, 21 do 24 nukleotidov dolge koščke siRNA. Takšna velikost molekulam siRNA zagotavlja maksimalno specifičnost in minimalne stranske učinke v obliki nezaželenih povezav. Specifičnost siRNA molekule za vezavo na mRNA je tako velika, da že sprememba enega samega nukleotida prepreči njeno RNAi-delovanje.V drugi fazi helikaza loči verigi siRNA. Protismiselna (antisense) veriga se veže na protein argonaut in se tako vključi v multiproteinski kompleks, imenovan RISC (RNA-induced silencing complex). Smiselna (sense) veriga se razgradi med procesom aktivacije RISC kompleksa. Teoretično bi se lahko katera koli veriga vključila v kompleks, vendar je ponavadi izbrana tista z bolj stabilnim 5'-koncem, saj ima pričakovano daljšo življenjsko dobo.Antisense veriga se v okviru kompleksa lahko veže na mRNA, ki ima njej komplementarno zaporedje nukleotidov. Znotraj RISC kompleksa Slicer, zaenkrat še

neindentificirana RNaza, prične z razgradnjo prostega dela mRNA molekule. Začetek razgradnje predstavlja 10. nukleotid na 5'-koncu tarčne mRNA. V RISC se lahko vklopijo tudi sintetično vnesene siRNA ali siRNA molekule divjega tipa. V tem primeru je razlika le v tem, da prva faza ni potrebna, saj so v celici že prisotne majhne molekule.

Delovanje miRNA se od delovanja siRNA razlikuje predvsem v začetnih fazah nastanka male RNA molekule.

24


V jedru se najprej prepiše primarna miRNA (primary miRNA, pri-miRNA), ki jo specifična ribonukleza, imenovana Drosha, preoblikuje v prekurzorsko miRNA (precursor miRNA, pre-miRNA), 70 nukleotidov dolgo lasnično zanko. Le-ta se transportira iz jedra v citosol, kjer jo Dicer razreže v zrelo miRNA. Zrela enoverižna molekula se vključi v kompleks, ki je analogen ali celo identičen RISC, miRNP. Povezava miRNA na mRNA nato sproži uničenje ali zavrtje delovanja tarčne molekule.Molekula miRNA običajno nima popolnoma komplementarnega zaporedja nukleotidov tarčni mRNA, zato se lahko veže na več molekul s podobnim zaporedjem. miRNA deluje na mRNA na več različnih načinov:

ф Lahko deluje na translacijo tako, da se veže na mRNA in s tem prepreči iniciacijo, upočasni elongacijo z vezavo na mRNA in polisome, povzroči prezgodnjo terminacijo ali razpad proteina med samim procesom.ф Drugi način delovanja je razgradnja poli A repa in s tem povzročitev razgradnje mRNA.ф miRNA lahko povzroči zadrževanje mRNA v GW telescih, imenovanih tudi citoplazemski (P) faktorji, ki so zgrajeni iz številnih encimov, ki so vključeni v regulacijo količine mRNA v celici: decapping proteini, deadenilaze, eksonukleaze, Argonavti, ipd. V P telescih se mRNA razgradi ali ohrani v mirujoči fazi. GW telesa delujejo kot shramba mRNA in ob potrebi molekule sprostijo v citoplazmo. Na ta način je reguliranih le malo molekul mRNA.

Stabilnost mRNA: Koncentracija mRNA v celici je odvisna od hitrosti nastajanja in razgradnje molekul. Pri prokariontih je življenjska doba mRNA nekaj min, pri evkariontih pa od nekaj h do nekaj dni. Razgradnja mRNA lahko poteče na več načinov. Za človeka je najpogostejši proces deadenilacije. Splošno za evkarionte pa je značilna eksonukleazna aktivnost od 3' proti 5' (za nižje organizme od 5' proti 3'). Vendar, ko se razgradi večina poli-A repa, se razgradi tudi kapa in pride tudi do razgradnje od 5' proti 3'.

Primer: Transferin in feritin♪ Transferin in feritin sta molekuli, ki skrbita za prenos Fe in s tem za njegovo količino v celici. Transferin prenaša Fe po ECM, feritin po ICM. Količina slednjega je uravnavana s stabilnostjo mRNA.♪ Železo je v prosti obliki škodljivo za celico, zato se mora ob njegovi povišani koncentraciji tvoriti več feritina. ♪ Kadar so na IRE vezani IRE-BP, razgradnja mRNA ne poteka, ker je prostor za proteine, ki vodijo molekulo v razgradnjo, zaseden.♪ Če je koncentracija Fe nizka, se IRE-BP inaktivirajo in prične se razgradnja mRNA molekul, saj fertin ni več potreben.

25


Glavne razlike med prokariontskim in evkariontskim uravnavanjem izražanja genov

ф dostopnost promotorja pri evkariontih je manjšaф prevladujeta različna tipa uravnavanja izražanja genovф pri prokariontih se uravnavanje odraža le na eni ravni (represorji)ф regulatorji pri evkariontih so bolj kompleksni in jih je več

26


43. Tehnologija rekombinantne DNA

43.1. Princip priprave rekombinantne DNA.Rekombinantna DNA je molekula DNA, ki jo dobimo z združevanjem različnih koščkov DNA v nova zaporedja. Rekombinantne tehnike so vsi mehanizmi s katerimi lahko dosežemo izdelavo, pomnoževanje in analizo rekombinantne DNA.

Restrikcijaki encimi so encimi, ki spoznajo specializirana mesta na DNA verigi in verigo v teh mestih cepijo. Pogosto delujejo na palindromna zaporedja, to so zaporedja, ki se enako berejo s 5' proti 3' in s 3' proti 5' koncu. Včasih je lahko na nekem mestu katerikoli nukleotid, vendar mora biti večina zaporedja palindrom. So endonukleaze in za svoje delovanje ne potrebujejo energije.

DNA verigo lahko režejo na dva različna načina: Vsako verigo razrežejo na drugem koncu, tako da novo

nastala delca nista povsod dvoverižna, ampak imata na koncu previs ali lepljiva konca.

Verigi cepi na obeh straneh tako, da sta novo nastala fragmenta ves čas dvoverižna in nastanejo topi konci.

Restrikcijski encimi izvirajo iz bakterij, ki jih potrebujejo za obrambo pred tujo bakterijsko DNA. Danes večinoma

uporabljamo umetno sintetizirane encime, ki nam pomagajo pri združevanju različnih fragmentov DNA. Ko neko DNA razrežemo, ji lahko dodamo komplementarne fragmente in s časom se bodo fragmenti med seboj združili. Ta čas bo zelo kratek, če bomo delali z lepljivimi konci in rahlo daljši, če imamo opravka s topimi konci. Vrzel, ki po povezavi še ostane, zapolni ligaza. Dobimo rekombinantno molekulo.

Če želimo novo molekulo DNA pomnožiti, jo moramo vstaviti v vektor, molekulo, ki tujo DNA lahko vnese v gostiteljsko celico. Poznamo različne vrste vektorjev: plazmide, bakteriofage γ, kozmide in umetne bakterijske kromosome. Med seboj se razlikujejo v velikosti DNA fragmenta, ki jim ga lahko vstavimo in tarčnih gostiteljskih celicah. Za bakterije najpogosteje uporabljamo plazmidne vektorje.

Plazmidi so izvenkromosomske krožne molekule DNA, ki se nahajajo v mnogih bakterijah prosto v citoplazmi. Značilnosti:

podvajajo se neodvisno od genomske DNA večinoma so majhne molekule, ki nosijo zapis le za nekaj genov s konjugacijo se lahko prenašajo med celicami pogosto vsebujejo gene, katerih produkti celici omogočajo odpornost na delovanje antibiotikov

Značilnosti plazmidnih vektorjev: ker so majhni, jim je relativno preprosto vstaviti fragmente DNA, vendar le ti ne

smejo preseči velikosti 15000 bp v bakterijo lahko vstavimo do 500 kopij vsebujejo veliko število zaporedij za vezavo restrikcijskih encimov, ki po vezavi na

ta mesta odprejo verigo (omogočijo vstavitev rekombinantne molekule) vsebujejo (selekcijske) markerje za prepoznavo in selekcijo, npr. gene za

odpornost proti antibiotikom ali za presnovo nekaterih snovi, ki omogočajo obarvanost kolonije

s konjugacijo ne morejo prehajati iz enega gostitelja v drugega

27


Priprava rekombinantnega plazmida:

Vektor razrežemo z restrikcijskim encimom in dodamo DNA fragmente, ki jih želimo vstaviti v vektor. Pri rezanju morajo nastati komplementarni konci. Fragment in plazmid se povežeta, zadnjo razpoko zapre ligaza. Sledi vnašanje plazmida v celico. Temu procesu pravimo transformacija. V gojišču namnožimo bakterije, ki jih podvržemo selekciji. Selekcijo naredimo na osnovi nove lastnosti, ki jo celica pridobi s plazmidom. Tako lahko npr. izbiramo kolonijo na podlagi njene barve ali pa celice postavimo v okolje z antibiotikom, kjer lahko preživijo samo celice z genom za odpornost.

Tvorba rekombinantnega plazmida ni edini način podvajanja točno določenega fragmenta DNA. To lahko izvedemo tudi s t.i. Polymerase Chain Reaction (PCR) v epruveti. Tehniko se uporablja pri nekaterih genskih raziskavah in v forenziki, za njen razvoj pa je bilo ključno odkritje termostabilne DNA polimeraze. Za izvedbo reakcije potrebujemo poleg polimeraze še vzorec DNA, začetni oligonukleotid (ang. primer) in deoksinukleotidne trifosfate. Primerji so kratki oligonukleotidi dolgi 18-25 bp, ki so komplementarni tarčni DNA.Verižna reakcija s polimerazo je sestavljena iz ponavljajočih ciklusov treh zaporednih reakcij:a) DENATURACIJAV prvi stopnji dvoverižno DNA izpostavimo visokim T (95oC) in jo na ta način denaturiramo. b) PRILEGANJE PRIMERJEVV raztopino dodamo začetne primerje, ki so komplementarni začetku in koncu fragmenta, ki ga želimo podvojiti. Nato T zmanjšamo na 50-60oC in omogočimo primerjem, da se pritrdijo na komplementarno zaporedje.c) PODVAJANJEV zmes dodamo polimerazo in T ponovno dvignemo, saj ima termostabilna polimeraza optimum delovanja pri 72°C. Poteče sinteza novih verig. Tako se zaključi prvi krog, vendar cikel še večkrat ponovimo, saj prvi dve tarčni molekuli dobimo po tretjem krogu. S številom ciklov število dolgih fragmentov narašča linearno, število kratkih (tarčnih) fragmentov pa eksponentno. Običajno cikel ponovimo okoli 30-krat, ko imamo že okoli milijardo

tarčnih molekul. Le te iz zmesi dobimo z gelsko elektroforezo.Pozitivni strani metode sta predvsem hitrost in zanesljivost, ki je posledica številnih ponovitev. Ima pa metoda tudi negativne strani, saj se lahko primerji hitro pritrdijo na

28


napačne dele DNA ali po pomoti pomnožujemo napačno DNA (npr. DNA iz prejšnjega poskusa, ki ni bila dobro izmita iz epruvete).

PRIPRAVA GENOMSKE KNJIŽNICEObičajno v posamezen plazmid vstavimo krajši fragment DNA z zapisom za nekaj genov, vendar lahko v gostiteljsko celico vnesemo tudi celoten genom. Genomsko DNA razrežemo in koščke vstavimo v plazmidne vektorje tako, da vsak vektor vsebuje najmanj en fragment. Plazmide vstavimo v bakterije in nato po princimu selekcije izločimo bakterije, ki ne vsebujejo nobenega plazmida. Populacijo transformiranih bakterij, od katerih vsaka vsebuje vsaj en košček genoma imenujemo genomska knjižnica.Velikost človeškega genoma je 6x109 bp, zato bi potrebovali več kot dva milijona bakterij, da bi zagotovili 99% verjetnost, da se v populaciji vsak fragment DNA pojavi vsaj enkrat. Zato se pogosteje sestavljajo knjižnice samo iz informacij, ki se v danem trenutku izražajo v celici. Takšno knjižnico imenujemo cDNA knjižnica. Za njeno izdelavo potrebujemo celično mRNA, ki jo moramo najprej prepisati v cDNA, ker v plazmide lahko vstavljamo le DNA molekule.mRNA najprej izoliramo iz celice. Sintetiziramo začetni T oligonukleotid, ki se nalega na poli A rep in tako reverzni transkriptazi omogočimo sintezo verige DNA. Rezultat je hibridna molekula iz mRNA in cDNA. Z RNazoH razgradimo mRNA in dodamo polimerazo, ki sintetizira komplementarno verigo. Dobimo dvoverižno molekulo cDNA, ki jo lahko vstavimo v vektor.

PREGLEDOVANJE KNJIŽNICV gojišču imamo bakterije, ki vsebujejo različne plazmide in posledično različne koščke genoma. Da bi našli iskani fragment, bakterije razmažemo po trdem gojišču tako, da dobimo kolonijo za vsak plazmid posebej. Problem nastane pri določanju katera kolonija vsebuje iskani fragment.Čez gojišče položimo filter, na katerega se bodo prijele bakterije, iz vsake kolonije nekaj. Izvedemo alkalno lizo, tako da na membrani dobimo enoverižne molekule, ki jih z UV žarki ali pečenjem stabiliziramo na membrano. Z označeno sondo izvedemo hibridizacijo. Nevezano sondo speremo, tako sonde ostanejo izključno na delih, kjer so vezane na iskani fragment. Sonde so najpogosteje radioaktivno označene, zato membrano postavimo pod rentgen in pogledamo, kje se pojavi črna barva. Nato primerjamo sliko z gojiščem in določimo v kateri koloniji je želen fragment.

29


Metoda po Southernu ali hibridizacija nukleinskih kislinFragmente s specifičnimi zaporedji v kompleksni zmesi nukleotidov najlažje poiščemo s procesom hibridizacije. Hibridizacija nukleinskih kislin je molekularno-biološka tehnika, ki omogoča zaznavanje podobnih ali enakih nukleotidnih zaporedji v nukleinskih kislinah dveh različnih organizmov ali v genomu istega organizma. Osnova zanjo je sposobnost nukleinskih kislin, da se po popolni denaturaciji, ko so ohranjene le še kovalentne vezi med nukleotidi, spontano ponovno renaturirajo. Ko govorimo o hibridizaciji, renaturacija poteka v zmesi nukleinskih kislin različnega izvora. Nastanejo lahko tri vrste povezav, DNA-DNA, DNA-RNA in RNA-RNA.Metoda je uporabna pri izolaciji genov, preučevanju izražanja genov, v diagnostiki in pri določanju sorodstvenih vezi ter iskanju osumljencev kaznivih dejanj. Izvedemo jo lahko na različnih preiskovalnih vzorcih: molekulah DNA genomskih ali cDNA knjižnic, z elektroforezo ločenih molekulah RNA ali z restrikcijskimi endonukleazami dobljenimi in z elektroforezo ločenimi fragmenti DNA.Za iskanje komplementarnih področji uporabljamo sonde, to so daljši ali krajši fragmenti DNA ali RNA. Označimo jih z radioaktivnim izotopom ali s fluorescenčnim reagentom. Velikost sonde, ki jo izberemo je odvisna od specifičnosti, ki jo želimo doseči. Za bolj specifično vezavo uporabljamo krajše sonde, če iščemo v neznanem organizmu analogen gen nekemu poznanemu pa raje uporabimo daljše sonde, ki bodo tvorile hibrid tudi pri nepopolnem ujemanju. Na specifičnost sonde

30

Levo: elektroforeza genomske DNASpodaj: elektroforeza plazmidne

DNA


poleg dolžine in komplementarnosti, vplivajo še razmerje AT:GC, ionska jakost in prisotnost denaturantov. Kadar poznamo protein in želimo iz njega napraviti sondo, moramo paziti na degeneriranost genskega koda. Izbrati moramo predel proteina, kjer je najmanj različnih možnosti za zapis ene AK, nato pa izdelamo vse možnosti in poskusimo, katera bo prava.Postopek hibridizacije:

zmes nukleinskih kislin ločimo z elektroforezo na gelu nukleinske kisline denaturiramo tako, da jih izpostavimo ekstremnim vrednostim pH-ja ali T › 80oC, in jih prenesemo na trden nosilec (introcelulozna ali najlonska membrana) vežemo jih z UV obsevanjem ali segrevanjem pri 80oC membrano damo v hibridizacijsko raztopino visoke ionske jakosti, ki vsebuje označeno in denaturirano sondo. Ker je sedaj pH nevtralna oz. T znižana, dosežemo naključno povezavo med molekulami na osnovi komplementarnosti. po hibridizaciji nespecifično vezano sondo speremo s pufrom nižje ionske jakosti kot jo ima hibridizacijska raztopina membrano izpostavimo filmu, ki ga izberemo glede na način označevanja sonde

Na enak način analiziramo tudi proteine (western) in RNA molekule (northern), le da fragmentacija ni potrebna, ker so molekule manjše.

SEKVENCIONIRANJE, določanje nukleotidnega zaporedja, ali METODA PO SANGER-ju

Princip metode temelji na encimski sintezi različno dolgih, radioaktivno ali fluorescenčno označenih, verig DNA v prisotnosti 2,3-dideoksinukleotidov (ddNTP). ddNTP-ji se normalno vgradijo v rastočo verigo nukleotidov, vendar onemogočajo njeno nadaljnjo rast, ker v sladkorni komponenti nimajo 3' hidroksilne skupine, ki je nujna za vezavo naslednjega nukleotida. Postopek sekvencioniranja zajema reakcijo polimerizacije in ločevanja ter detekcijo nastalih produktov. Ker v zmes damo tudi normalne dNTP-je, se sinteza novih verig ustavi na različnih mestih in fragmente lahko, po končani reakciji, z elektroforezo razvrstimo po velikosti. Vendar moramo zanjo uporabiti poliakrilni gel, ker je le ta dovolj natančen, da zazna razliko v dolžini enega samega nukleotida. Reakcije lahko izvajamo v 4 ločenih zmeseh ali v eni sami.

Ker so fragmenti radioaktivno ali fluorescenčno označeni, zaradi označitve nekaterih komponent, lahko preberemo njihovo zaporedje nukleotidov. Zaporedje beremo od spodaj (najkrajši fragmenti) navzgor.

31


*Poznamo še druge postopke določanja nukleotidnega zaporedja, vendar imajo vsi enak osnovni princip in se razlikujejo zgolj po količini DNA, ki je potrebna, vrsti uporabljene polimeraze, v načinu označevanja ter posledično ločevanja sintetiziranih verig, dolžini določenega nukleotidnega zaporedja in stopnji natančnosti.

DNA FINGERPRINTINGDNA fingerprinting je metoda za ugotavljanje sorodnosti in razlik v genetskem materialu na osnovi mikrosatelitske DNA. Mikrosatelitske DNA so majhni fragmenti DNA, ki se v genomu velikokrat ponovijo, število in mesto ponovitev pa je pri vsakem posamezniku drugačno. Verjetnost, da imata dva različna človeka enako razporeditev mikrosatelitskih DNA je zanemarljiva, zato to metodo uporabljamo za dokazovanje sorodnosti, odkrivanje osumljencev kaznivih dejanj, ipd.Potek:

DNA dodamo restrikcijske encime, ki jo razrežejo na različno dolge fragmente, glede na zaporedje nukleotidov. DNA inkubiramo. Sledi elektroforeza v agaroznem gelu in analiza rezultatov s primerjavo fragmentov DNA.

UPORABA V MEDICINSKI DIAGNOSTIKIPrej opisane tehnike lahko uporabimo predvsem pri odkrivanju in določanju mutacij, vendar lahko različne mutacije otežujejo samo izvedbo nekaterih postopkov.

Mutacija spremeni cepitveno mesto: β-globin pri β-talasamijiČe mutacija izniči cepitveno mesto, pri fragmentiranju eden od fragmentov ostane daljši, kot bi bil sicer. Izvedemo Southern in dodamo označeno sondo za fragment, katerega dolžina se spreminja glede na prisotnost oz. odsotnost mutacije. Analiziramo dobljene signale in

opazujemo prisotnost daljšega oz. krajšega segmenta. To tehniko imenujemo tudi RFLP (restriction fragment lenghth polymorphism).Bližnjica, za ugotavljanje takšnih mutacij:Damo oligonukleotidne začetke in pomnožimo predel, kjer je lahko prisotna mutacija (PCR). Delčke nato cepimo in z elektroforzo ugotavljamo ali imamo prisoten en ali dva delčka.

32


Mutacija ne spremeni cepitveno mesto:Naredimo dve sondi, eno za normalno in eno za mutirano verigo, ki sta vezani na membrano. Po opravljeni detekciji ugotavljamo katera sonda je prisotna v vzorcu. To imenujemo PCR-SSO (seqence specific oligonucleotides).Podobno lahko ugotavljamo ali se začetni nukleotid ujema z matrico ali ne. Če se ujema, bo polimeraza delovala, če ne pa ne.

Ugotavljanje delecij in duplikacijEn ali nekaj bp: sekvenčna analizaNekaj 10 do nekaj 100 bp: PCRNekaj 1000: RFLP (po southernu)

Ugotavljanje sprememb števila tandemskih ponovitev: PCR, če so ponovitve samo na enem mestu v genomu ali z analizo po Southernu, če se ponovitve pojavljajo na več različnih mestih na genomu.

Glavni vir• Breskvar, K., Črešnar, B., Dolžan, V., Plemenitaš, A., Rozman, D. in Žakelj-Mavrič, M. Biokemija II: Navodilo za vaje. Ljubljana: Univerza v Ljubljani, Medicinska fakulteta, 2007.• Predavanja prof. Bronislave Črešnar 2007/08• Predavanja prof. Vite Dolžan 2007/08• Seminar: PCR 2007• Seminar: Alternativno izrezovanje intronov 2008• Seminar: miRNA in RNA interferenca 2008

33

Documents

01. Molekularna Genetika