5. VIRUSI

Virusi su genetički elementi koji se mogu replicirati samo u odgovarajućoj ćeliji domaćinu, te su zbog toga označeni kao obligatni intracelularni paraziti (obligatni = obavezni, intracelularni = unutarćelijski). Poseduju sopstveni genom, ali su potpuno zavisni od ćelije domaćina - za replikaciju svog genoma koriste energiju, intermedijere metabolizma, enzime i ribozome ćelije domaćina.

Virusi nemaju ćelijsku strukturu, oni su acelularni (acelularni = ne-ćelijski) i to je verovatno osnovni razlog zbog koga neki autori smatraju da se virusi nalaze na granici između živog i neživog. Međutim, činjenice da oni poseduju nukleinsku kiselinu u kojoj je zapisana nasledna informacija, kao i svojstvo replikacije, nedvosmisleno ih određuju kao žive organizme. Virusi su specijalizovani za različite ćelije domaćine i do danas su otkriveni virusi koji napadaju ćelije sva tri domena živog sveta. Tako razlikujemo viruse prokarota (viruse bakterija - bakteriofage/fage i viruse arhea) i viruse eukariota (viruse protozoa, gljiva, biljne i animalne viruse).

STRUKTURA VIRUSASvi virusi poseduju metabolički inertnu (metabolički neaktivnu) ekstracelularnu

formu, koja omogućuje virusu ‘transfer’ od prethodne ćelije domaćina do sledeće. Ekstracelularna forma virusa označena je kao virion (virusna čestica, virusna partikula, slika 5.1) i izgrađena je iz kapsida (proteinskog omotača) i genoma virusa, koji može biti ili DNK ili RNK molekul. Većina bakterijskih virusa nema dodatni omotač oko kapsida, međutim za mnoge animalne viruse je karakteristično da se na površini nalazi i dodatni omotač koji je ćelijskog porekla (slika 5.2). Pošto vodi poreklo od ćelijske membrane prethodnog domaćina, on je po hemijskoj strukturi fosfolipid. U virusologiji se koristi i termin nukleokapsid, kojim zajedno označavamo nukleinsku kiselinu i kapsid viriona. Ovaj termin se naročito koristi kod virusa sa dodatnim omotačem.

Veličina virusnih čestica najčešće se kreće se u intervalu 20-300 nm (1 nm = 10 -9 m); postoje i virusi koji poseduju veće virione, ali je to retka pojava. Kao primere ekstrema u veličini možemo navesti sa jedne strane poliovirus, sa dijametrom od 28 nm, a sa druge virus velikih boginja, sa dijametrom oko 200 nm. Međutim, postoje i virusne čestice koje značajno prevazilaze ove, najčešće dimenzije; takvi su npr. virusi koji parazitiraju na amebama:

1

Slika 5.1. Tipičan izgled viriona bakteriofaga (levo) i elektronska mikrografija ćelije bakterija sa adsorbovanim virionima na površini

Slika 5.2. Shematski prikaz razlike u strukturi virusne čestice ‘golog’ i virusa sa dodatnim omotačem

Pandoravirus, čiji ikosaedarni kapsid ima dijametar ~1µm (1000 nm) i do sada najveći Pithovirus sibericum, čiji je kapsid dužine ~1,5 µm (1500 nm), a dijametar ~500 nm. Sa ovakvim dimenzijama, ovi virusi ameba se približavaju dimenzijama najmanjih bakterijskih ćelija (slika 5.3).

Slika 5.3. Primeri najvećih do sada otkrivenih virusnih čestica - 1. Megavirus chilensis (dijametar kapsida 440 nm), 2. Mimivirus (dijametar kapsida 750 nm), Pandoravirus (dijametar kapsida ~1000 nm) i Pithovirus sibericum (dužina kapsida ~1500 nm, dijametar ~500nm)

U formi viriona virus je neaktivan, ali je njegova nasledna informacija zaštićena od različitih nepovoljnih uticaja spoljašnje sredine koji bi mogli da je oštete. Pored zaštitne uloge, virion ima značaja i u prepoznavanju potencijalnih ćelija domaćina, pošto specifični proteini na površini virusne čestice (protini kapsida ili virusni proteini uronjeni u dodatni omotač) prepoznaju specifične receptore na površini ćelije domaćina i vezuju se za njih. Treća, ali ne manje značajna funkcija viriona, jeste i pakovanje specifičnih enzima kodiranih virusnim genomom, koji su neophodni za odvijanje životnog ciklusa virusa.

Virusni genomZa razliku od ćelijskog sveta, u kome je nasledna informacija uvek zapisana u

dvolančanom DNK genomu, u nećelijskom svetu virusa raznovrsnost genoma je ogromna. Najpre, genom može biti ili DNK ili RNK molekul, pa razlikujemo DNK i RNK viruse. Obe ove grupe su dalje podeljene na jednolančane i dvolančane viruse. Postoji manji broj virusa koji tokom svog životnog ciklusa poseduju i DNK i RNK, ali su ove faze vremenski odvojene, tako da DNK i RNK nikada ne koegzistiraju zajedno u virionu (slika 5.4). Zatim, virusni genomi mogu biti linearni ili cirkularni, a postoje i virusi sa segmentiranim genomom. Kada govorimo o jednolančanim virusnim genomima, oni mogu biti plus ili minus konfiguracije (smisla). Plus virusi imaju genom u kome je redosled baza identičan kao u iRNK, osim što u slučaju DNK plus virusa timin zamenjuje uracil. Kada govorimo o plus RNK virusima, njihov genom u ćeliji odmah može poslužiti kao iRNK, odnosno biti matrica za sintezu virusnih proteina, što se po pravilu i dešava. Termin minus jednolančani virus koristi se za obrnute slučajeve, tj. onda kada je redosled baza komplementaran iRNK, što znači da takav RNK virus ne može poslužiti kao iRNK, već samo kao matrica za njenu sintezu.

2

Slika 5.4. Raznovrsnost virusnih genoma

Veličina virusnih genoma je varijabilna, ali po pravilu je manja od genoma ćelijskih organizama; oni najčešće kodiraju od nekoliko do 170 gena. Najmanji virusni genom je DNK molekul dužine oko 2000 nukleotida, koji sadrži samo dva gena. Naime, animalni virus Porcine circovirus  poseduje jednolančani cirkularni DNK genom dužine 1768 nukleotida. Sa druge strane postoje i veoma veliki virusni genomi, kao što je DNK genom Megavirusa, dužine oko 1,25 Mbp. Po pravilu RNK virusi imaju kraće genome, tako da samo DNK virusni genomi mogu kodirati više od 40 gena.

Osnovna podela virusa izvršena je na osnovu tipa domaćina u kome virusi parazitiraju, dok su primarni kriterijumi za njihovu klasifikaciju upravo tip virusnog genoma, kao i strategije reprodukcije koje koriste tokom infekcije. Najpotpunija je Baltimorova shema klasifikacije virusa (slika 5.5), koju je predložio američki biolog Dejvid Baltimor (David Baltimore), dobitinik Nobelove nagrade u oblasti fiziologije i medicine 1975. godine za otkriće retrovirusa.

Slika 5.5. Baltimorova shema klasifikacije virusa

Arhitektura kapsida - virusna simetrijaStruktura virusnih čestica je varijabilna, kako u pogledu veličine, o čemu je već bilo

govora, tako i u pogledu oblika i hemijske kompozicije. Kada govorimo o obliku viriona, važno je objasniti strukturu kapsida. Kapsid je izgrađen iz pojedinačnih proteina, kapsomera, koje genom okružuju u precizno definisanom obrascu, određujući specifičan tip simetrije virusa. Složenost strukture kapsida korelisana je sa veličinom genoma - kapsomere virusa sa malim genomom su, po pravilu, sve izgrađene iz istih proteinskih molekula (primer je TMV - tobaco mosaic virus), dok virusi sa velikim genomom poseduju nekoliko različitih tipova proteina u svojim kapsidima. Informacija neophodna za odgovarajuće aranžiranje kapsomera (u upotrebi je termin ‘asembliranje’; engl. assembly - sklapanje, sastavljanje) određena je

3

redosledom aminokiselina u proteinima. To znači da primarna struktura proteina kapsomera određuje ne samo njihovu sekundarnu, tercijarnu i kvaternernu strukturu, već određuje i način njihovog međusobnog povezivanja u kapsid. Kažemo da je ovo spontan proces, odnosno da virusi imaju sposobnost samo-asembliranja (engl. self-assembly). Pored sposobnosti samo-asembliranja, neki virusi zahtevaju i asistenciju proteina ćelije domaćina. Primer je λ (lambda) bakteriofag, koji parazitira na E. coli; njegovo sklapanje u aktivnu konformaciju zahteva učešće bakterijskog šaperonina GroE.

Virusne čestice pokazuju izrazitu simetričnost u odnosu na odgovarajuću osu simetrije. Razlikujemo dva osnovna tipa simetrije koji određuju oblik virusa (slika 5.6). Virusi štapićastog (filamentoznog) oblika imaju spiralnu (helikalnu) simetriju, a virusi sferičnog oblika ikosaedarnu simetriju (ikosaedar je geometrijsko telo izgrađeno iz 20 jednakostraničnih trouglova). Ikosaedarna simetrija predstavlja najefikasniji oblik aranžiranja subjedinica - sa najmanjim brojem kapsomera genom određenih dimenzija će biti upakovan i zaštićen.

Slika 5.6. Spiralna simetrija virusa (levo) i ikosaedarna simetrija virusa (desno)

Pored virusa koji imaju jedan od ova dva osnovna tipa simetrije, postoje i virusi čija je struktura kompleksna; oni su izgrađeni iz dva ili više delova, koji su međusobno strukturno različiti, tj. pokazuju različite tipove simetrije. Najsloženija je struktura tzv. kompleksne simetrije, koju karakterišu kapsidi izgrađeni iz dva dela - glave, ikosaedarne simetrije, u koju je upakovan genom, i repića, spiralne simetrije (struktura glava-rep, slika 5.7) Kompleksna simetrija ovog tipa nije otkrivena među virusima eukariota; najsloženija je kod nekih bakteriofaga (npr. T4 fag), ali se javlja i među virusima arhea. Inače, virusi arhea pokazuju najveću raznovrsnost u pogledu morfotipova. Sa druge strane, iako tipična kompleksna simetrija (struktura glava-rep) nije uočena kod eukariotskih virusa, i među njima postoje virusi koji su strukturno kompleksni, kao što je mimivirus (slika 5.3).

Slika 5.7. Kompleksna simetrija bakteriofaga T4 (levo)

4

Virusi sa omotačemPostoje virusi čiji je nukleokapsid okružen dodatnim omotačem koji je ćelijskog

porekla (slika 5.8). Naime, nakon reproduktivnog ciklusa virus ćeliju napušta pupljenjem, noseći sa sobom deo citoplazmatične membrane. Ova pojava je pre svega karakteristična za animalne viruse, pošto su animalne ćelije okružene samo ćelijskom membranom, te je ovakva strategija izlaska virusa iz ćelije efikasna. Sa druge strane, kod biljnih virusa i bakteriofaga, virusa sa omotačem gotovo i da nema (postoji samo nekoliko izuzetaka), što se objašnjava činjenicom da se na površini njihovih ćelija domaćina nalazi i ćelijski zid, koji pojavu pupljenja otežava/onemogućava.

Dodatni omotač virusa sa omotačem je strukturno isti kao i ćelijska membrana, s tom razlikom da su u fosfolipidni dvosloj membrane uronjeni specifični virusni proteini. Njihova uloga u prepoznavanju sledećeg domaćina i oslobađanju iz ćelije prethodnog domaćina je esencijalna: naime, oni prepoznaju specifične receptore na površini ćelije domaćina i adsorbuju se za njih.

Slika 5.8. Virusi sa dodatnim omotačem - elektronske mikrografije virusa influence (levo) i vakcinija virusa (desno)

Enzimi unutar virusnih česticaVirusi su izvan ćelije domaćina metabolički inertni, međutim, u virusne čestice su

često upakovani specifični enzimi, kodirani od strane virusnog genoma, koji omogućavaju infekciju odgovarajućih ćelija domaćina, ili su neophodni u nekoj fazi životnog ciklusa virusa u ćeliji (slika 5.9). Tako neki bakteriofagi nose upakovan enzim lizozim, kojim u peptidoglikanskom sloju ćelije domaćina stvaraju male pukotine, kroz koje virusni genom prodire u ćeliju domaćina. Osim uloge u penetraciji (prodiranju) virusne nukleinske kiseline u ćeliju, lizozim je potreban i za oslobađanje zrelih virusnih čestica iz ćelije. Slično je i kod nekih animalnih virusa; npr. virus influence (gripa) u svom dodatnom omotaču na površini viriona nosi enzim neuraminidazu, koji razgrađuje glikoproteine i glikolipide vezivnih tkiva, čime olakšava sebi pristup do ćelija potencijalnih domaćina.

5

Slika 5.9. Shema virusnih enzima koji mogu biti upakovani u virusnu česticu

Osim toga, za pojedine grupe virusa je karakteristično da ne mogu kompletirati svoj životni ciklus koristeći samo enzime i strukture ćelije domaćina, već moraju da kodiraju i sopstvene, specifične enzime, koji po pravilu katalizuju procese nesvojstvene ćelijskom metabolizmu. Ukoliko su takvi enzimi neophodni u incijalnim fazama infekcije, pre nego što dođe do sinteze virusnih proteina u ćeliji, oni će biti preformirani i upakovani u kapsid. Kao primere možemo navesti enzime RNK zavisnu RNK polimerazu i reverznu transkriptazu. U slučaju RNK virusa, neophodan je enzim koji će replicirati RNK (katalizovati sintezu RNK sa RNK matrice) i taj enzim je označen kao RNK replikaza. Ukoliko je reč o plus RNK virusima, enzim ne mora biti upakovan u kapsid, jer će virusni genom poslužiti kao matrica za sintezu proteina, a samim tim i RNK replikaze. Međutim, u slučaju minus RNK virusa ovo nije moguće, pa će enzim biti upakovan u kapsid i prilikom infekcije ubačen u ćeliju domaćina, zajedno sa genomom. Sa druge strane, za retroviruse i hepadnaviruse (grupe animalnih virusa o kojima će biti reči kasnije) je karakteristično da tokom svog životnog ciklusa vrše reverznu (obrnutu) transkripciju, tj. sa RNK kao matrice sintetišu DNK. Kako ćelija ne poseduje odgovarajući enzim, virusi kodiraju enzim reverznu transkriptazu; ovaj enzim je upakovan u virion i unosi se u ćeliju prilikom infekcije.

ŽIVOTNI CIKLUS VIRUSA - OPŠTI PREGLEDDa bi se virus replicirao, on mora metabolizam ćelije podrediti sebi, tj. omogućiti da

se u ćeliji sintetišu sve komponente koje su esencijalne za kompletiranje životnog ciklusa, odnosno umnožavanje virusa. S obzirom da je to energetski zahtevan proces, virus će se umnožavati samo u ćelijama koje aktivno metabolišu (metabolički neaktivne ili mrtve ćelije ne mogu podržati umnožavanje virusa). Ćeliju koja podržava kompletnu replikaciju virusa označavamo kao permisivnu (permisivna ćelija/permisivni domaćin, lat. dopušten, dozvoljen). Iz različitih razloga, koji će biti navedeni u daljem tekstu, infekcija može biti neuspešna, što znači da neće rezultirati reprodukcijom virusa i tada govorimo o tzv. abortivnoj infekciji virusom.

Kada se virusni genom nađe u permisivnom domaćinu, može doći do jednog od dva potpuno različita sleda događaja. U prvom slučaju dolazi do takozvane litičke (virulentne) infekcije. Za nju je karakteristično da virus preuzima metaboličku kontrolu nad domaćinom i reprodukuje se, dajući kao rezultat veliki broj novih virusnih čestica koje se oslobađaju iz inficirane ćelije. Za litičku infekciju je karakteristično da u životnom ciklusu virusa razlikujemo 5 osnovnih faza (slika 5.10):

6

1. Adsorpcija obuhvata prepoznavanje specifičnih receptora na površini permisivne ćelije i vezivanje za njih (slika 5.11). Receptori su površinske strukture i to mogu biti proteini, ugljeni hidrati, glikoproteini, lipidi ili lipoproteini; oni imaju određenu fiziološku ulogu, ali su se virusi tokom evolucije prilagodili da ih prepoznaju i vežu se za njih. Tako su receptori T1 faga proteini uključeni u transport gvožđa, receptori λ faga kanali za transport maltoze i sl. Mnogi virusi se specifično adsorbuju na dodatne ćelijske strukture, kao što su flagele ili pili. U slučaju da je receptor strukturno izmenjen, adsorpcija neće biti uspešna, jer virus neće moći da prepozna izmenjeni receptor. Ćelije sa strukturno izmenjenim receptorom su označene kao mutanti rezistentni na određeni tip virusa.

Slika 5.11. Adsorpcija i penetracija genoma faga (levo) i pakovanje i oslobađanje virusa iz ćelije domaćina pupljenjem (desno)

7

Slika 5.10. Osnovne faze litičke infekcije virusa

2. Penetracija predstavlja ulazak virusnog genoma ili virusne čestice u ćeliju. Po pravilu, bakteriofagi kompleksne simetrije injektiraju svoj genom u ćeliju, dok je za animalne i biljne viruse karakteristično da celi virioni ulaze u ćeliju.

3. Faza replikacije virusa obuhvata sintezu svih virusnih struktura, tj. genoma i proteina virusa (termin replikacija u bukvalnom prevodu znači pravljenje kopija). Ova faza odvija se uz učešće metaboličkog aparata domaćina (enzimi, ribozomi), ali je pod virusnom kontrolom (sintezom specifičnih enzima, virus podređuje metabolizam ćelije sebi). Kada govorimo o replikaciji virusnog genoma, u slučaju DNK virusa može se koristiti DNK polimeraza domaćina, ali to je slučaj sa DNK virusima sa malim genomom. Sa druge strane, kompleksniji DNK virusi veoma često kodiraju sopstvenu DNK polimerazu, kao i druge proteine neophodne u metabolizmu DNK (primaze, helikaze i sl). Kada govorimo o sintezi proteina, ona se, naravno, uvek odvija na ribozomima domaćina.

4. Maturacija (sazrevanje) virusa je proces formiranja zrelih virusnih čestica. Odvija se kroz sklapanje (asembliranje) virusnih genoma i proteina kapsida.

5. Sledi oslobađanje virusnih čestica, koje se često odvija uz lizu ćelije domaćina. Međutim, nije retka pojava, naročito kod animalnih virusa, da se virusne čestice oslobađaju pupljenjem, noseći sa sobom dodatni omotač ćelijskog porekla (slika 5.11).

Sa druge strane, postoji i lizogena infekcija, koja se javlja samo kod nekih virusa. U lizogenoj infekciji ne dolazi do reprodukcije virusa, već se virusni genom stabilno integriše u genom ćelije domaćina i tako prenosi na njeno potomstvo.

BAKTERIOFAGIZa proučavanje životnog ciklusa virusa dugo su korišćeni isključivo modeli

bakteriofaga i odgovarajućih bakterija domaćina. Iako je u današnje vreme moguće gajiti i animalne i biljne ćelije u kulturi, model fag/bakterija je i dalje veoma koristan za ispitivanje životnog ciklusa virusa i odnosa virus - domaćin. Kada govorimo o bakteriofagima, kažemo da oni mogu ući u dva životna ciklusa - litički i lizogeni ciklus. Fage koji mogu ući isključivo u litički ciklus nazivamo virulentnim, dok fage koji ulaze i u litički i u lizogeni ciklus nazivamo umerenim bakteriofagima (slika 5.12).

Manifestacije umnožavanja bakteriofaga na ’bakterijskom tepihu’ (konfluentan rast bakterija na čvrstoj hranljivoj podlozi) su prosvetljena mesta vidljiva golim okom, označena kao plake. U plakama se nalaze virusi nastali umnožavanjem jedne virusne čestice, odnosno one predstavljaju klonove virusnih čestica. Postoje dva tipa plaka: svetle, koje su karakteristične za virulentne viruse i mutne, koje su karakteristične za umerene viruse (slika 5.12). Kao model organizmi za studiranje virulentnih i umerenih bakteriofaga najbolje su proučeni fagi T4 i λ, oba parazitiraju na bakteriji Escherichia coli.

8

Slika 5.12. Virusne plake – svetle plake virulentnih faga (levo), mutne plake umerenih faga

(u sredini) i uporedna slika plaka (desno)

T4 bakteriofag T4 bakteriofag E. coli je tipičan virulentni virus i on sa svojim domaćinom ulazi

isključivo u litički ciklus. Rezultat uspešne infekcije permisivnog domaćina je liza ćelije i oslobađanje oko 100 novih virusnih partikula. To je virus kompleksne simetrije (slika 5.13): u glavu je upakovana linearna dvolančana DNK, a repić, sa bazalnom pločom i kukicama na svom kraju služi za adsorpciju i penetraciju virusne DNK u ćeliju domaćina. DNK T4 faga, koji kodira oko 250 različitih proteina, karakterišu dva svojstva - cirkularna permutacija i terminalno ponavljanje gena.

Životni ciklus virusa započinje adsorpcijom, a u slučaju T4 faga receptori su ugljenohidratni molekuli LPS (lipopolisaharidnog) sloja ćelijskog zida bakterije. Za svoje receptore T4 se vezuje bazalnom pločom. Na krajevima bazalne ploče nalaze se dva tipa kukica - duge (tail fibers, vlakna) i kratke (tail pins, iglice). Adsorpcija započinje kontaktom dužih kukica sa receptorima, što dovodi do njihove retrakcije (uvlačenja, skraćivanja), čime se omogućava kontakt kratkih kukica i cele bazalne ploče sa površinom ćelije. Kako je u virion upakovan enzim lizozim, ovaj kontakt omogućava virusu da lizozimom napravi malu poru u ćelijskom zidu, što je neophodno za sledeću fazu. Penetracija se odvija injektiranjem virusne DNK, koja je olakšana sposobnošću repa da se kontrahuje (kažemo da je rep kontraktilan, tj. može da se skraćuje). Na površini ćelije nakon penetracije ostaju prazni kapsidi, tzv. duhovi (ghosts).

Ubrzo nakon infekcije dolazi do replikacije virusa (slika 5.14); za manje od pola sata proces se završava lizom ćelije i oslobađanjem novih virusnih čestica. Nakon ulaska virusne DNK prestaje sinteza ćelijskih DNK i RNK. Dolazi do sinteze virusnih proteina, a u zavisnosti od vremena pojavljivanja u inficiranoj ćeliji, oni su označeni kao rani, srednji i

9

Slika 5.13. T4 bakteriofag – elektronska mikrografija (levo) i shematski prikaz (desno)

kasni proteini. Najpre dolazi do sinteze ranih proteina, zahvaljujući činjenici da promotore ranih gena prepoznaje i transkribuje ćelijska RNK polimeraza sa konstitutivno prisutnim σ70

faktorom. U grupu ranih proteina spadaju (1) enzim za sintezu 5-hidroksimetil citozina, neuobičajene baze koja ulazi u sastav virusne DNK, (2) nukleaza koja iseca genom domaćina, (3) specifična virusna DNK polimeraza i (4) proteini koji modifikuju afinitet RNK polimeraze domaćina (anti-σ70 protein koji vezuje za sebe σ70 faktor domaćina i na taj način sprečava dalje prepoznavanje i transkripciju bakterijskih gena; (5) alternativni σ faktor koji omogućava RNK polimerazi prepoznavanje promotora srednjih virusnih gena). Srednji proteini uglavnom obuhvataju dodatne alternativne σ faktore koji dalje menjaju afinitet RNK polimeraze, usmeravajući je na promotore kasnih virusnih gena. Na kraju dolazi do sinteze strukturnih proteina kapsida i lizozima, koji čine grupu kasnih proteina.

Slika 5.14. Životni ciklus T4 bakteriofaga

Sa sintezom srednjih virusnih proteina vremenski je sinhronizovana replikacija virusnog genoma pomoću virusne DNK polimeraze (slika 5.15). Genom se replicira u lineranoj formi, a pošto se formira više kopija sa lepljivim krajevima, dolazi do njihovog spajanja, čime nastaje konkatemer (džinovski molekul u kome su svi geni prisutni u velikom broju kopija). Proces isecanja konkatemera u pojedinačne genome, koji vrši fagna endonukleaza, odvija se u fazi maturacije. Naime, kada su sve strukturne komponente budućih virusnih čestica formirane (sintetisane kapsomere i oformljen konkatemer), može doći do procesa sklapanja proteina i pakovanja virusne DNK u glave kapsida. U procesu sklapanja dolazi najpre do formiranja praznih prekursora glava, u koje se DNK ubacuje dokle god se glava ne napuni (tzv. headful mehanizam). Ubacivanje DNK je energetski zahtevan proces (ćelija obezbeđuje ATP), a onda kada je glava napunjena, endonukleaza vrši isecanje DNK. Pošto u glavu staje fragment DNK duži od jedne kopije svih virusnih gena, kada svi geni uđu sa po jednom kopijom u glavu, pakovanje se nastavlja. Upravo zbog toga se javlja terminalno ponavljanje gena - geni na krajevima su ponovljeni. Zbog činjenice da endonukleaza ne zaseca DNK virusa na tačno definisanim mestima, već onda kada se glava napuni, terminalno ponovljeni geni u različitim fagnim česticama će biti različiti, tj. doći će

10

do pojave koju označavamo terminom cirkularne permutacije gena (lat. permutacija - zamenjivanje, menjanje mesta u nizu elemenata).

Punjenje glave podrazumeva ne samo pakovanje virusnog genoma, već i pakovanje male količina lizozima, koja će biti neophodna da omogući infekciju sledećeg domaćina. Kada je glava puna, dodaju se i kapsomere koje izgrađuju repić, čime se proces sazrevanja virusa završava. Na kraju dolazi do lize ćelije (aktivnošću virusnog lizozima) i oslobađanja oko 100 novih virusnih čestica. Ceo proces je izuzetno brz i traje oko 25 minuta. Ukoliko se ciklus razmnožavanja virusa u bakterijama domaćinima više puta ponovi, a bakterije konfluentno rastu na čvrstoj hranljivoj podlozi, doći će do formiranja svetlih plaka, u kojima se nalaze ostaci liziranih ćelija i ogroman broj virusnih čestica (slika 5.12).

Umereni bakteriofagi Za razliku od virulentnih faga, koji obavezno ulaze u litički ciklus, postoje i umereni

fagi, koji po ulasku u ćeliju domaćina mogu ući u litički ciklus i reprodukovati se, ali mogu i integrisati svoj genom u ćelijski, čime sa domaćinom uspostavljaju stabilan odnos označen kao lizogeni ciklus. Ukoliko dođe do uspostavljanja lizogenog ciklusa, ćelija domaćin je označena kao lizogena bakterija, a bakteriofag kao profag. U stanju profaga ne dolazi do transkripcije većine virusnih gena, već se virusni genom sinhrono replikuje sa hromozomom domaćina i svaka ćerka ćelija dobija po jednu njegovu kopiju.

Lizogena bakterija integracijom virusnog genoma može steći nova svojstva i u tom slučaju kažemo da je došlo do lizogene konverzije. Najizrazitiji primer je bakterija Corynebacterium diphtheriae, izazivač difterije, koja proizvodi toksin (važan faktor patogenosti) jedino ukoliko je lizogenizovana sa bakteriofagom β, integrisanim u hromozom domaćina. Naime, informacija neophodna za sintezu toksina je kodirana od strane fagnog, a ne bakterijskog genoma, tako da su samo lizogene ćelije patogene.

Dva najbolje proučena umerena bakteriofaga su λ i P1, oba parazitiraju na Escherichia coli. Oni mogu ući kako u litički, tako i u lizogeni ciklus, a odluka o tome u koji će ciklus ući

11

Slika 5.15. Replikacija genoma T4 bakteriofaga – formiranje konkatemera i pojave terminalnog ponavljanja i cirkularne permutacije gena u virusnim genomima

nakon infekcije ćelije je složen proces, koji podleže kaskadi regulatornih događaja. Litički ciklus oba faga se principijelno ne razlikuje od već opisanog tipičnog litičkog ciklusa, drugim rečima nakon adsorpcije i penetracije virusnog genoma dolazi do replikacije virusa, sazrevanja novoproizvedenih virusnih čestica i njihovog oslobađanja u spoljašnju sredinu. Međutim, kada ulaze u lizogeni ciklus, ova dva faga se različito ponašaju. Dok se genom λ faga integriše u bakterijski hromozom, genom P1 faga se ponaša kao plazmid i u stanju profaga ostaje u ćeliji u formi ekstrahromozomalne DNK. Iako nije integrisan u genom domaćina, on se, kao i plazmidi, replicira sinhrono sa hromozomom, tako da i ćelije potomci dobijaju kopiju genoma P1faga i ostaju lizogene. U daljem tekstu objasnićemo prirodu umerenih bakteriofaga na primeru λ faga.

Lambda (λ) fag - litički vs. lizogeni ciklus umerenih virusa λ fag (slika 5.16) je DNK virus kompleksne simetrije. Genom je linearni dvolančani

molekul sa kohezivnim krajevima (cos mesta – cohesive sites), tj. jednolančanim, međusobno komplementarnim regionima dužine 12 nukleotida. Kada penetracijom virusni genom prodre u ćeliju, on se zahvaljujući kohezivnim krajevima cirkularizuje.

Slika 5.16. Elektronska mikrografija λ faga (levo) i shema penetracije i cirkularizacije

genoma faga

U toj fazi virus ‘odlučuje’ u koji će ciklus ući, a kao što ćemo videti u daljem tekstu, to je uslovljeno energetskim stanjem u ćeliji (slika 5.17). Ukoliko virus ulazi u lizogeni ciklus, on prelazi u stanje profaga i integriše se u bakterijski hromozom. Integracija se odvija rekombinacijom specifičnom za mesto, zahvaljujući komplementarnosti kratkih regiona attB (attachment site of bacteria) na hromozomu i attP (attachment site of phage) u fagnoj DNK, a katalizovana je enzimom integrazom (mesto-specifičnom endonukleazom). U hromozomu E. coli attB mesto se nalazi između gena gal (korišćenje galaktoze) i bio (sinteza biotina) (slika 5.18).

12

Kako bi se održao u lizogenom ciklusu, virus mora blokirati ekspresiju sopstvenih gena koji su odgovorni za njegovu replikaciju, a koji su eksprimirani tokom litičkog ciklusa. ‘Litičke gene’ drži zaključanim represor λ faga CI. Dakle, tokom lizogenog ciklusa jedini virusni gen koji se transkribuje je upravo gen za CI represor. Međutim, kako se virus usmerava u lizogeni ciklus u ćeliji? Proces regulacije ulaska u lizogeni ili litički ciklus je veoma složen, šta više, smatra se da je regulatorni sistem λ faga jedan od najsloženijih među do sada poznatim regulatornim putevima u virusologiji.

Uprošćena shema regulacije nas upućuje na dva ključna proteina koji alternativno regulišu ulazak u jedan od ciklusa. To su Cro i CI proteini; oba su represori i sintetišu se brzo nakon ulaska u ćeliju, pre nego što se fag nepovratno usmeri u jedan od ciklusa. Transkripcija njihovih gena otpočinje sa različitih promotora – dok se Cro transkribuje sa promotora PR (promoter right – desni promotor), CI se transkribuje najpre sa promotora PE

(promoter establishment – promotor uspostavljanja lizogenog ciklusa), a zatim sa promotora PM (promoter maintenance – promotor održavanja lizogenog ciklusa). Dok je CI represor litičkih gena (uključujući i gen za Cro protein), koji fag usmerava u lizogeni ciklus, Cro je represor sinteze CI represora, koji fag usmerava u lizogeni ciklus. Ključno mesto regulacije su tri gotovo identične sekvence (1, 2 i 3) koje čine operatorsko mesto OR. Operatorsko mesto OR se nalazi između promotora PM i PR i učestvuje u regulaciji ekspresije sa oba promotora (slika 5.19). Mesta 1, 2 i 3 su mesta vezivanja oba represora, ali je afinitet njihovog vezivanja različit. Cro se najpre vezuje za mesto 3 i time najpre blokira promotor PM, a time i sintezu CI sa ovog promotora. Sa druge strane, CI se sa najvećim afinitetom vezuje za mesto 1, blokirajući ekspresiju sa PR, a time i gena za Cro protein.

13

Slika 5.17. Shema životnog ciklusa umerenih virusa: litički vs. lizogeni ciklus; prelazak iz lizogenog u litički ciklus – lizogena indukcija

Slika 5.18. Integracija λ faga mesto specifičnom rekombinacijom u genom ćelije domaćina

Na ovaj način međusobno suprotstavljene uloge Cro i CI represora određuju kojim će putem krenuti fag. Međutim, da li je stvar slučaja hoće li biti više jednog ili drugog proteina, ili postoji mehanizam koji, u zavisnosti od uslova u ćeliji, određuje da li će se fag usmeriti u litički ili lizogeni ciklus? Naravno, biološki sistemi su visoko regulisani i nikada ne prepuštaju stvari ‘slučaju’. Količina represora CI, a time i međusobni odnos količina CI i Cro, od koga ulazak u jedan od ciklusa direktno zavisi, je uslovljen energetskim stanjem u ćeliji. Naime, za stabilizaciju CI proteina neophodni su virusni proteini CII i CIII, koji kaskadno regulišu proces i određuju koliko će biti represora CI u ćeliji. CII je aktivator promotora PE, dakle neophodan za inicijalnu sintezu represora CI. Količina CII u ćeliji zavisi od količine proteina CIII, koji ga stabiliše. Dakle, jedino ukoliko ima dovoljno CIII proteina, protein CII će biti stabilan i moći će da aktivira transkripciju sa promotora PE, znači i početnu sintezu CI represora (slika 5.20).

Kako je ovo usklađeno sa energetskim stanjem u ćeliji? U uslovima dobrog energetskog stanja dolazi do intenzivne sinteze svih proteina u ćeliji, pa i bakterijskih proteaza. Specifične bakterijske proteaze degraduju protein CIII, što povlači kaskadu događaja – nema proteina CIII, ali nema ni CII ni CI proteina virusa. To znači da će Cro represora biti u višku i da će on prvi blokirati transkripciju na operatoru OR, što za posledicu ima ulazak u litički ciklus. Sa druge strane, loše energetsko stanje znači da nema proteaza koje bi sekle CIII, što u krajnjoj liniji dovodi do nagomilavanja CI proteina koji ‘pretiče’ Cro i usmerava virus u lizogeni ciklus.

Kakav je biološki smisao ovakve regulacije? Dobro energetsko stanje je pokazatelj da će ćelija imati energije za litički ciklus koji je energetski jako zahtevan (replikacija virusa i

14

Slika 5.19. Operatorsko mesto OR i regulacija sinteze CI i Cro represora – određivanje ulaska u lizogeni ili litički ciklus

Slika 5.20. Alternativni ulazak u litički ili lizogeni ciklus

proizvodnja velikog broja kopija zahteva intenzivnu sintezu virusnih proteina i replikaciju njegovog genoma). Sa druge strane, u uslovima lošeg energetskog stanja u ćeliji, postoji opasnost da neće biti dovoljno energije da se litički ciklus i završi. U takvim uslovima virusu je ‘isplativije’ da integriše svoj genom u bakterijski hromozom i izvrši lizogenizaciju bakterije. Na ovaj način osigurano je umnožavanje virusnog genoma, jer će svi potomci lizogene bakterije takođe nositi λ profag u svom hromozomu.

Lizogene bakterije će imati jedno bitno svojstvo - zahvaljujući prisustvu CI represora, one će biti imune na ponovnu infekciju λ fagom (istorodnim tipom faga). U slučaju da se nova čestica λ faga adsorbuje i dođe do ubacivanja njenog genoma u lizogenu ćeliju, CI represor će odmah prepoznati regulatorne sekvence ‘pridošlice’ i blokirati ekspresiju njegovih litičkih gena. Zahvaljujući ovome, ponovna infekcija istorodnim tipom faga je abortivna, jer je lizogena bakterija stekla imunost. Zbog imunosti lizogenih bakterija na ponovnu infekciju, plake koje se formiraju na bakterijskom tepihu usled umnožavanja umerenih virusa su mutne (slika 5.12). Na mestu gde je formirana plaka virus je inicijalno ušao u litički ciklus (u suprotnom, plake ne bi ni bilo). Međutim, u više puta ponovljenim događajima oslobađanja novih virusnih čestica i infekcija novih ćelija domaćina, pojedine virusne čestice će ulaziti u lizogeni ciklus. Lizogene bakterije, koje zahvaljujući tome nastaju, su imune na ponovnu infekciju istorodnim tipom faga, te nesmetano rastu u zoni plake i dovode do njenog zamućenja. Dakle, u zoni mutnih plaka nalaze se ostaci liziranih ćelija, infektivne virusne čestice, ali i lizogene bakterije.

Virus u stanju profaga može vrlo dugo opstajati u ćeliji, međutim, može doći i do prelaska virusa iz lizogenog u litički ciklus, što je označeno terminom lizogena indukcija. Lizogena indukcija predstavlja proces isecanja profaga iz bakterijskog hromozoma, što je obrnut proces u odnosu na proces integracije faga. To znači da ponovo dolazi do rekombinacije specifične za mesto između att regiona levo i desno od integrisanog profaga, što je katalizovano enzimima ekscizionazom i integrazom. Po isecanju dolazi do ekspresije litičkih gena, što za krajnju posledicu ima produkciju velikog broja novih zrelih virusnih čestica, koje se iz ćelije oslobađaju nakon njene lize. Do pokretanja ove kaskade događaja dolazi usled toga što se razgrađuje CI represor; kada se on ukloni sa operatorskih sekvenci, dolazi do transkripcije litičkih gena, koji su bili pod njegovom represijom.

Zbog čega dolazi do razgradnje CI represora faga? Okidač za njegovu razgradnju je delovanje stresornih agenasa koji oštećuju DNK. Pojava većih oštećenja na molekulu DNK uslovljava indukciju složenog SOS odgovora kod E. coli. To je inducibilni odgovor kojim ćelija pokušava da preživi stresnu situaciju i izvrši reparaciju nastalih oštećenja na molekulu DNK. Naime, agensi koji oštećuju DNK, kao što je npr. UV zračenje, dovode do razgradnje SOS represora i otključavanja SOS gena, čiji su produkti uključeni u popravku oštećenja i odlaganje ćelijske deobe. Međutim, λ fag se tokom evolucije prilagodio, tako što je i njegov CI represor postao supstrat za razgradnju u uslovima stresa. Isti molekularni događaji koji su odgovorni za uklanjanje SOS represora sa SOS gena bakterije, odgovorni su i za uklanjanje CI represora sa fagnih litičkih gena. Na ovaj način virusni genom napušta oštećeni hromozom i ulazi u litički ciklus, koji će mu omogućiti da se reprodukuje i napusti ćeliju čiji je opstanak ugrožen.

15

U toku litičkog ciklusa dolazi do sinteze virusnih proteina i do replikacije njegovog genoma. Replikacija cirkularizovane virusne DNK otpočinje po modelu θ (teta) replikacije, bidirekciono (dvosmerno) sa jednog oridžina replikacije, ali brzo prelazi u oblik kotrljajućeg obruča (rolling circle replication, slika 5.21). Replikacija po modelu kotrljajućeg obruča je jednosmerna i odvija se sa mesta zaseka na jednom lancu cirkularne DNK. Drugi, intaktni lanac služi kao matrica, dok se na 3’-kraj zasečenog lanca dodaju nukleotidi. Dodavanjem nukleotida dolazi do istiskivanja 5’-kraja lanca. Istisnuti lanac zatim služi kao matrica na kojoj se sintetiše komplementarni lanac, tako da se dobija dvolančani konkatemer. Sa konkatemera se na specifičnoj sekvenci (cos mesta) isecaju fragmenti odgovarajuće veličine. Isecanje je asimetrično i ostavlja lepljive (kohezivne) krajeve. Ovako dobijeni DNK molekuli se pakuju u glave novosintetisanih faga, a fagi se po kompletnom sazrevanju oslobađaju u spoljašnju sredinu lizom ćelije.

Jednolančani DNK bakteriofagiDo sada opisani bakteriofagi imaju genom u formi dvolančane DNK, a sada ćemo se

upoznati sa jednolančanim DNK fagima na primeru faga ΦX174 i M13.Fag ΦX174 (slika 5.22) je ikosaedarne simetrije, a njegov genom je jednolančana

cirkularna plus DNK (jednolančani minus DNK fagi nisu otkriveni). Njegov virion je veoma mali (dijametar je ~25 nm). Genom je jako kratak, dužine 5386 nt i karakteriše ga prisustvo preklapajućih gena (overlapping genes). Pojava preklapajućih gena je česta kod virusa sa malim genomom. Kako bi se tako mali genomi mogli efikasno iskoristiti za zapisivanje kompletne nasledne informacije, geni sa različitim okvirima čitanja su međusobno preklopljeni. Osim što se kod ΦX174 faga isti nukleotidni zapis čita iz različitih okvira tokom transkripcije, postoji i fenomen da se jedna iRNK može iskoristiti za sintezu dva različita proteina A i A*. Naime, i proces translacije može krenuti sa dva različita mesta na iRNK, što rezultira nastankom dva proteina – A je kompletan protein i odgovoran je za zasecanje plus lanca dvolančane replikativne forme DNK, dok protein A*, koji je odgovoran za blokiranje replikacije ćelijske DNK, nastaje translacijom jednog dela iRNK.

16

Slika 5.21. Replikacija fagnog genoma po modelu kotrljajućeg obruča (rolling circle replication)

Slika 5.22. Fag ΦX174 – izgled viriona (levo), cirkularni genom sa fenomenom

preklapajućih gena (u sredini) i shema životnog ciklusa (desno)

Po ulasku u ćeliju, jenolančana DNK se prevodi u dvolančanu replikativnu formu (RF). To je cirkularni molekul koji se replicira po modelu kotrljajućeg obruča, slično kao kod λ faga. Ovde minus lanac služi kao matrica i sintezom sa njega nastaje jednolančani plus lanac. Kada on dostigne dimenziju genoma, A protein vrši njegovo isecanje i cirkularizaciju, kako bi u cirkularnoj formi bio spakovan u kapsid. Zreli fagi se oslobađaju lizom ćelije.

Fag M13 je filamentozni virus sa jednolančanom plus cirkularnom DNK (slika 5.23). On napada bakteriju Escherichia coli, ali samo ćelije koje su donori u konjugaciji (F+ ćelije) i to zato što se adsorbuje na ‘seks’ pilus F+ ćelije (F- ćelije ne poseduju pilus). Za njega je karakteristično da ne ubija ćeliju nakon svog reproduktivnog ciklusa, već se iz ćelije oslobađa pupljenjem. Zbog toga ne daje potpuno prosvetljene plake na bakterijskom tepihu, tj. ne postoje mesta lize ćelija. Međutim, zone njegovog umnožavanja na bakterijskom tepihu su ipak uočljive, jer umnožavanje virusa u ćeliji troši energetske resurse ćelije. Zbog sporijeg metabolizma u inficiranoj zoni ćelije sporije rastu, tepih je stanjen i to se može uočiti. Replikacija M13 faga je slična onoj kod ΦX174. Sazrevanje i pakovanje genoma u kapsid se vrši prilikom izlaska virusa iz ćelije. Naime, DNK faga se u ćeliji okružuje specifičnim C proteinima virusa. Prilikom izlaska iz ćelije, C protein se zamenjuje proteinom kapsida (proteinom A), koji se nalazi u citoplazmatičnoj membrani. M13 virus je našao zapaženo mesto u biotehnologiji; naime, zahvaljujući činjenicama da poseduje i jednolančanu i dvolančanu (replikativnu) formu genoma, kao i da ne ubija ćeliju domaćina, on je jedan od često korišćenih vektora u genetičkom inženjerstvu.

Slika 5.23. Bakteriofag M13 – filamentozni virion i cirkularni genom (levo) i oslobađanje faga iz ćelije pupljenjem, uz sazrevanje virusnih čestica (desno)

17

RNK bakteriofagi Većina bakteriofaga iz ove grupe poseduju jednolančani plus RNK genom i tipičan

primer je fag MS2 (slika 5.24), koji parazitira na F+ ćelijama Escherichia coli (receptori se nalaze na pilima koji su kodirani F faktorom). MS2 virus je ikosaedarne simetrije, što je karakteristično za RNK bakteriofage. U virusnu česticu dijametra 25 nm upakovan je genom dužine svega 3569 nt i jedna kopija maturacionog proteina. Genom kodira 4 proteina. To su maturacioni protein, protein kapsida, protein za lizu i jedna subjedinica RNK replikaze (ostale subjedinice su ćelijskog porekla). Maturacioni protein je proteaza, koja obrađuje virusne polipeptide, što je neophodno za formiranje infektivnih viriona. Kako je genom MS2 plus RNK, on se odmah po ulasku u ćeliju koristi kao iRNK i dolazi do translacije virusnih proteina. Sintetisana RNK replikaza vrši prepisivanje plus lanca u minus lanac, koji zatim služi kao matrica za sintezu novih kopija plus lanca koje će služiti kao genom i kao iRNK.

Slika 5.24. Bakteriofag MS2: Genetička mapa plus RNK genoma faga i elektronska mikrografija faga adsorbovanih na pilus F+ ćelije (levo) i životni ciklus virusa (desno)

Kao i u slučaju drugih malih genoma, genom MS2 faga se odlikuje genima koji se preklapaju. Tako se gen za lizirajući protein preklapa sa genima za protein kapsida i subjedinicu RNK replikaze. Osim što fenomen preklapajućih gena čini male genome efikasnijim u pogledu količine nasledne informacije, on zajedno sa sekundarnom strukturom RNK molekula omogućava i specifičnu regulaciju životnog ciklusa virusa, što se ogleda u kontroli dinamike translacije pojedinih proteina. Tako je start kodon gena za lizirajući protein teško dostupan ribozomima na početku životnog ciklusa, što sprečava prerano liziranje ćelije. Zatim, dostupnost start kodona za subjedinicu replikaze zavisi od količine proteina kapsida u ćeliji - oni se vezuju za RNK u tom regionu. Kapsomere sintetisane u dovoljnoj količini blokiraju translaciju replikaze; ona više neće biti potrebna, jer je, pored kapsomera, u ćeliji prisutan i dovoljan broj RNK genoma, tako da maturacija virusa može da otpočne. Nakon toga, nove virusne čestice se oslobađaju u spoljašnju sredinu lizom ćelije.

Do danas nisu otkriveni bakteriofagi sa minus RNK genomom, ali je dokazano postojanje faga sa dvolančanim RNK genomom; najbolje proučen među njima je fag φ6 (fi 6), koji parazitira na bakterijama roda Pseudomonas (slika 5.25). Najtipičniji domaćin je biljni patogen Pseudomonas syringe. Virion odlikuje ikosaedarna simetrija, a neobična

18

pojava je postojanje unutrašnjeg i spoljašnjeg kapsida. Ova osobina se sreće i kod animalnih reovirusa, sa kojima je φ6 srodan. Još jedno svojstvo ovog faga, karakteristično pre svega za animalne viruse, je postojanje spoljašnjeg lipidnog omotača koji je ćelijskog porekla. Genom faga je segmentiran, sastavljen iz tri fragmenta. Ovo je virulentni fag, tj. sa ćelijom domaćinom ulazi isključivo u litički ciklus.

Slika 5.25. Bakteriofag φ6: shema viriona (levo) i elektronska mikrografija (desno)

VIRUSI ARHEADo nedavno se smatralo da virusi koji parazitiraju na predstavnicima domena Archaea

poseduju isključivo DNK genom. Međutim, pre nekoliko godina je metagenomska analiza uzoraka vode iz vrelih izvora Nacionalnog parka Jelouston (Yellowstone) ukazala na moguće postojanje RNK virusa arhea, što otvara novo istraživačko polje u oblasti virusologije. Dosadašnja otkrića iz ove oblasti pokazuju da su u pitanju jednolančani plus RNK virusi, paraziti Crenarchaeota. Ako govorimo o DNK virusima, treba istaći da nekolicina poseduje jednolančani DNK genom, ali najveći broj do sada otkrivenih virusa arhea poseduje dvolančanu DNK. Genomi virusa arhea su dominantno cirkularni, ali su opisani i linearni. Iako je većina do sada otkrivenih virusa virulentno, otkriće provirusa u genomu jedne mezofilne vrste razdela Thaumarchaeota ukazuje da i među njima ima umerenih virusa, koji mogu ući u lizogeni ciklus.

Generalno gledano, virusi arhea pokazuju veliku varijabilnost u morfologiji, sa različitim varijacijama spiralnih, ikosaedarnih i kompleksnih simetrija. Do sada je opisan veliki broj različitih morfotipova (slika 5.26).

Morfološki najdivergentniju grupu virusa arhea sačinjavaju oni koji parazitiraju na hipertermofilima iz razdela Crenarchaeota. Tako je hemolitotrof Sulfolobus domaćin nekoliko strukturno različitih virusa koji, s obzirom na stanište koje ove arhee naseljavaju, moraju biti rezistentni na ekstremno visoke temperature i niske pH vrednosti (slika 5.27). SSV virus (spindle-shaped virus) ima virione oblika vretena, koji su često grupisani u rozete, a genom je cirkularna dvolančana DNK. Drugi morfološki oblik imaju SIFV virusi (Sulfolobus islandicus filamentous virus) spiralne simetrije, koji parazitiraju na Sulfolobus islandicus.

19

Slika 5.26. Različiti morfotipovi virusa prokariota. Morfotipovi koji se susreću u oba domena, ili samo kod Archaea su sledeći: (1) kompleksna simetrija sa dugim kontraktilnim repićem (Siphoviridae); (2) kompleksna simetrija sa dugim nekontraktilnim repićem (Myoviridae); (3) kompleksna simetrija sa kratkim repićem (Podoviridae); (4) ikosaedarni (Tectiviridae, Corticoviridae, Turriviridae, Sphaerolipoviridae); (5) oblik kapljice (droplet-shaped , Guttaviridae, APOV1); (6) oblik boce (bottle-shaped, Ampullaviridae); (7) sferni, sa spiralnom srži (Globuloviridae); (8) plejomorfni oblik (Pleolipoviridae); (9) baciliformni (Clavaviridae); (10) oblik štapića (rod-shaped, Rudiviridae); (11) filamentozni (Lipothrixviridae); (12) oblik kalema sa namotajima (coil-shaped, Spiraviridae); (13) oblik vretena sa kratkim repom (spindle-shape, Fuselloviridae, Salterprovirus); (14) oblik vretena sa dugim repom (STSV1, STSV2, SMV1, APSV1); (15) oblik vretena, sa dva duga repa (Bicaudaviridae).

Još jedna jedinstvena morfološka karakteristika virusa arhea opisana je kod virusa ATV (slika 5.28), koji parazitira na Acidianus convivator, bliskom srodniku Sulfolobus. Kada ATV virus (Acidianus two-tailed virus) napusti ćeliju domaćina on ima vretenastu formu bez

20

Slika 5.27. Virusi paraziti Sulfolobus spp: virioni SSV vretenastog oblika grupisani u rozete (levo) i virion SIFV spiralne simetrije (desno)

repića. Zatim virus ex vivo razvija dva duga repa, sa obe strane ove vretenaste forme. Promena morfološkog oblika nakon napuštanja ćelije moguća je zahvaljujući činjenici da se odgovarjući enzim, neophodan za promenu oblika, pakuje u kapsid. Enzim se aktivira jedino u uslovima ekstremno visokih temperatura i niskih pH vrednosti, dok virusne čestice na niskim temperaturama ostaju morfološki neizmenjene. Smatra se da promena oblika na neki način omogućava preživljavanje ekstremnih uslova. U svakom slučaju, sposobnost izmene oblika ex vivo donekle ruši dogmu da su virusi potpuno metabolički inertni izvan ćelije domaćina.

Kada govorimo o virusima koji parazitiraju na predstavnicima razdela Euryarchaeota, pomenućemo virus PAV1. To je virus kompleksne simetrije, sa glavom vretenastog oblika i kratkim repićem (slika 5.29), a domaćin mu je Pyrococcus abyssi (PAV1, Pyrococcus abyssi virus 1). On je morfološki sličan SSV virusu Sulfolobus, mada genomska analiza ukazuje na veoma mali stepen homologije, što ukazuje da su oni evolutivno udaljeni. Za njega je specifično da se iz ćelije domaćina, nakon reprodukcije, oslobađa bez njene lize, slično kao M13 bakteriofag E. coli. PAV1 je, kao i njegov domaćin, rezistentan prema visokim temperaturama.

Virusi metanogena i halofila iz razdela Euryarchaeota imaju kompleksnu simetriju, sa genomom upakovanim u glavu kapsida i repićem koji služi penetraciji. Predstavnici su ΦH virus koji parazitira na Halobacterium salinarum i ΦCh1 koji parazitira na haloalkalofilu Natrialba magadii. Oba virusa imaju linerni dvolančani genom sa cirkularno permutovanim i terminalno ponovljenim genima, slično kao T4 bakteriofag. Kao i T4, i ovi virusi pakuju genom po principu headful mehanizma.

21

Slika 5.28. ATV (Acidianus two-tailed virus): forma bez repića, neposredno nakon napuštanja ćelije domaćina (b) i vretenasta forma viriona sa repićima na oba pola (a, c)

Slika 5.29. Vretenast virion PAV1 virusa, parazita na Pyrococcus abyssi

ODBRANA PROKARIOTA OD VIRUSNIH INFEKCIJAU uslovima konstantne izloženosti virusnim infekcijama, prokariotske ćelije su tokom

evolucije razvile specifične odbrambene mehanizme od stranih DNK. Jedan od uslova uspešne odbrane bilo je sticanje sposobnosti prepoznavanja i razlikovanja strane DNK od sopstvenog genoma. Na ovom svojstvu se zasnivaju strategije za odbranu prokariotskih ćelija od konstantne izloženosti stranim DNK elementima, a to su restrikciono-modifikacioni (R-M) sistem i CRISPR sistem.

Restrikciono-modifikacioni sistem R-M sistem je prisutan kod velikog broja prokariota, kako bakterija tako i arhea, a služi

odbrani od strane DNK, koja može biti i virusnog porekla. Sistem odbrane se zasniva na postojanju enzima - restrikcionih endonukleaza, koje prepoznaju i seku dvolančanu DNK na specifičnim sekvencama (slika 5.33). Mesta zasecanja DNK lanaca, takozvana restrikciona mesta, su palindromske sekvence. Palindromi su invertovani ponovci prisutni u naspramnim lancima DNK (sekvenca palindroma pročitana u jednom lancu s leva u desno, a u drugom s desna u levo je identična). Ukoliko dođe do napada ćelije dvolančanim DNK virusom, specifične restrikcione endonukleaze mogu prepoznati restrikciona mesta ’pridošlice’, što će dovesti do fragmentacije virusne DNK, a time i sprečavanja replikacije virusa. Na ovaj način, ćelija se odbranila od virusnog napada. Naravno, R-M sistem nije efikasan prema RNK i jednolančanim DNK virusima.

Međutim, postavlja se pitanje kako ćelija ne iseče sopstvenu DNK na restrikcionim mestima? Kako bi se zaštitila od sopstvenih restrikcionih endonukleaza, ćelija svoja restrikciona mesta modifikuje, najčešće tako što ih metiluje. Zahvaljujući ovom specifičnom R-M sistemu, prokariotska ćelija je stekla sposobnost razlikovanja ’svog’ od ’stranog’ dvolančanog DNK molekula (slika 5.34). Međutim, neki DNK virusi mogu ’prevariti’ R-M sistem ćelije. Tako je T4 fag tokom evolucije stekao sposobnost modifikacije sopstvenih restrikcionih mesta. Kod njega je citozin zamenjen 5-hidroksimetilcitozinom koji može biti dodatno i glikozilovan (adicijom glukoze na hidroksilnu grupu 5-hidroksimetilcitozina, slika 5.35), čime fagna DNK postaje rezistentna prema specifičnim restrikcionim endonukleazama domaćina.

22

Slika 5.33. Restrikcija i modifikacija DNK.(a) Sekvence koje prepoznaju pojedine restrikcione endonukleaze i načini zasecanja lanaca koji ostavljaju lepljive ili ravne krajeve.(b) Modifikacija sopstvenih restrikcionih mesta, u cilju zaštite od restrikcionih endonukleaza

CRISPR sistemDrugi odbrambeni mehanizam prokariota, sposoban da štiti ćeliju od virusne DNK (a

ponekad i od DNK molekula koji su u ćeliju ubačeni konjugacijom), zasnovan je na sintezi specifičnih RNK molekula koji ’obeležavaju’ stranu DNK. Ovako obeleženi ’uljez’ u ćeliji postaje supstrat za specifične nukleaze. Ovaj sistem odbrane je označen kao CRISPR sistem (clustered regularly interspaced short palindromic repeats, ’grupisani pravilno prekinuti kratki palindromski ponovci’). On predstavlja specifično prokariotsko ’imunološko pamćenje’, tj. omogućava memorisanje sekvenci strane DNK koja je u bilo kom pređašnjem trenutku (tokom životnog veka klona) prodrla u ćeliju.

U hromozomu prokariota postoji specifični CRISPR region koji predstavlja svojevrsnu kolekciju upamćenih stranih DNK sekvenci, omogućavajući nadzor nad sopstvenim genomom. Region je sastavljen od različitih fragmenata strane DNK (spejseri, spacers) koji su umetnuti između kratkih palindromskih ponovaka (repeats), karakterističnih za ćeliju domaćina. Drugim rečima, u sekvenci CRISPR regiona se smenjuju različiti spejseri i identični ponovci (slika 5.36). Prilikom ekspresije CRISPR regiona dolazi do transkripcije u celosti, u jednu veliku pre-crRNK.

Slika 5.36. CRISPR sistem bakterija

23

Slika 5.34. R-M sistem bakterija Slika 5.35. Baza specifična za DNK T4 faga - 5-hidroksimetilcitozin

Pored CRISPR regiona, za funkcionisanje ovog sistema su neophodni i specifični Cas-proteini (CRISPR-associated proteins), koji omogućavaju odbranu ćelije. Pojedini među njima su zaduženi za integraciju ’novopridošlih’ spejsera u region (fragmentišu stranu DNK i umeću fragmente između dva ponovka, što je omogućeno prepoznavanjem specifične sekvence ponovka). Drugi Cas proteini su odgovorni za isecanje transkripta CRISPR regiona u manje fragmente označene kao CRISPR RNK (crRNK). Kako se isecanje na fragmente vrši sredinom svakog ponovka, male crRNK nose po jedan spejser, uokviren sa obe strane delom ponovka. Ove crRNK služe kao ’obeleživači’ novopridošlih DNK koje pokazuju homologiju sa ranije integrisanim spejserima. Naime, zahvaljujući homologiji sekvence crRNK i npr. DNK nekog virusa koja je prodrla u ćeliju, doći će do njihovog komplementarnog sparivanja. Homologija može, ali ne mora biti apsolutna, što znači da se prepoznaju i slične sekvence. Na ovaj način, strana DNK je obeležena za degradaciju u kojoj takođe učestvuju specifični Cas proteini koji deluju kao nukleaze. Pored strane DNK, CRISPR sistem može prepoznati i RNK molekul stranog porekla (npr. fagnu iRNK ili genom RNK virusa) i degradovati ga. Do sada su identifikovana tri glavna tipa CRISPR sistema koji se donekle razlikuju u obradi pre-crRNK i interferenciji sa stranom DNK/RNK. Zahvaljujući CRISPR sistemu, ćelije se uspešno brane od virusnih napada.

Sekvenciranje genoma različitih prokariota je pokazalo da je CRISPR sistem veoma široko rasprostranjen među različitim prokariotima, uključujući i Bacteria i Archaea. Dosadašnje analize pokazuju da oko 70% genoma analiziranih bakterija i čak 90% genoma analiziranih arhea poseduje CRISPR sistem. Efikasnost ovog sistema je prvi put registrovana u industriji mlečnih proizvoda, gde osetljivost starter kultura prema povremenim infekcijama bakteriofagima može dovesti do velikih ekonomskih gubitaka. Međutim, određeni soj Streptococcus thermophilus je bio rezistentan na infekciju specifičnim bakteriofagima. Uporedne genetičke analize sojeva S. thermophilus koji su bili rezistentni ili osetljivi na ove fage pokazale su da u prvom slučaju postoje fag-specifični spejseri u okviru CRISPR regiona.

Iako je CRISPR sistem veoma efikasan odbrambeni mehanizam prokariota, postoje virusi koji ne mogu biti prepoznati od strane ovog sistema, a molekularne osnove ovog fenomena još uvek nisu poznate.

24