البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

المختبر الثالث عشر والرابع عشر البكتريا المعويه

Enterobacteraiceaeالمقدمة

تضم عائلة المعويات اجناس متعددة يصعب التمييز بينها تحت المجهر .عصيات سالبة بصبغة غرام ،

متحركة او غير متحركة ، لاتكون سبورات تبلغ 0.7 – 0.5 مايكرون طولا 5-3حجومها من

مايكرون عرضها ، جميعها مخمرة لسكر الكلوكوز ، سالبة لاختبار الاوكسيديز مع بعض الشواذ موجبة

الى نتريت NO3لاختبار الكاتاليز ، وتختزل النترات NO2 .الموطن الطبيعي لها الامعاء الدقيقة للانسان

تشكل E. coliوالحيوان حتى ان قسما منها مثل البكتريا الطبيعية للامعاء في حين ان انواعاً اخرى

تعتبر مرضية خطرة Shigella وال Salmonella مثل الللانسان .

اهم الاجناس التي تضمها Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter,

Serratia, Salmonella, Proteus, Shigella, Yersinia, Providencia, Hafnia, Morganella, Pseudomonas,

Acinetobacter, Alcaligenesالعينات

تؤخذ العينات في الحالات المرضية من الادرار ، الخروج ، او في المياه في حالات الانواع الحرة

المعيشة .اهم الفحوصات التفريقيه

Tryptophan فحص تحلل التربتوفانHydrolysis ( Indole )

1

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

.Eبعض الانواع البكتيريه مثل coli تملك القابليه على شطر الحامض الاميني التربتوفان الى مك__ونين هم__ا

Pyruvic و الح___امض الب___ايروفي Indoleالان___دول acid والان__زيم المس__ؤول عن عملي__ه التحل__ل ه__ذه ه__و

. يمكن تش__خيص الان__دولTryptophanaseالتربتوف__اينيز .Kovacs’ reagentبسهوله بواس__طة كاش__ف كوف__اكس

عنE. coliهذا الفحص مفيد جدا في تشخيص بكتريا الانواع البكتيريه المعويه القريبه منها. يس__تخدم م__اء

Peptoneالببت__ون Water او Tryptone broth (1%)في ه__ذا .Tryptophanالفحص لاحتوائهم__ا على كمي__ه كب__يره من

الببتون يشتق من كازائين مهضوم بواس__طة عص__ارةالبنكرياس.

الموادKovacs’ reagent

Tryptone broth or Peptone water E. coli culture

س__اعه24بعد تلقيح الوسط بالبكتريا يحض__ن لم__دة م ، لغرض فحص الاندول يض__اف لل__بروث37بدرجة ’Kovacs قط__ره من كاش__ف كوف__اكس 12-10الملقح

reagentتكوين حلق__ه حم__راء على الطبق__ه العلي__ا من . الانبوبه دلي__ل على الفحص الايج__ابي

للاندول. تخمر السكريات المختلطه

Mixed Acid ( Methyl-Red ) Fermentation

2

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

العديد من البكتريا المعويه )سالبة الكرام خصوصا(، يمكن تفريقه__ا عن بعض__ها بواس__طة الن__اتج النه__ائي لعملية الايض الخاصه به__ا عن__دما تس__تهلك الكلوك__وز

-Methyl Red and Voges-Proskauer (MR)تخمره( على وسط VP) بعض الانواع البكتيريه مث__ل .Escherichia, Salmonella,

Proteus و Aeromonas تخمر الكلوكوز لتنتج كميات كبيره Lacticمن حامض اللاكت__ك Acidح__امض السكس__نيت ،

Succinic Acid و حامض الفورميك Formic Acid بالاضافه الى CO2 ، H2و الايثانول

Ethanolتجمع هذه الن__واتج ت__ؤدي الى . للوسط الى م__ادون ال_)pHخفض ال_

اذا ما اضيف المثيل الاحم__ر الى.(5 هك__ذا وس__ط )ذو حامض__يه مرتفع__ه( س__يتكون ل__ون احم__ر )ل__ون ال__دليل الم___ثيلي(، فنس___تنتج ب___ان الك___ائن المجه__ري الن__امي في الوس__ط ه__و

Mixedمخمر لحوامض مختلط__ه ) Acid Fermenterتعت__بر الاحي__اء المجهري__ه .)

المخم__ره للح__واض المختلط__ه عموم__ا منتج__ه للغ__ازformicوذلك بسبب انتاجها لانزيم Hydrogenylase وال_ذي

يقوم بشطر حامض الفورميك الى جزئين متساويين.CO2 ، H2 من

الموادMR-VP broth

E. coli and Klebsiella cultureMethyl-Red Indicator

Methyl-Red قط____رات من 4-3يض____اف Indicatorالى MR-VPالان__ابيب الحاوي__ه على وس__ط broth والملقح__ه

، ظهور اللون الاحمر التوتيKlebsiella و E. coliببكتريا

3

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

Cherry Red مباش__رة بع__د اض__افة الكاش_____ف دلال_____ه على الفحص

الموجب لاحمر المثيل. فحص تخمر البيوتانيدويل

Butanediol Fermentation ( Voges- Proskauer )

الفحص الس___لبي لاحم___ر المثي___ل يمكن ان يعد دلاله على ان الكائن

MR-VPالمجهري المنمى في وسط broth 2,3 منتج لكميات كبيره من,

( والايثانول ب__دلا عن انت__اجButanediol,__ 2,3بيوتانيدويل ) بالاض__افهSerratia و Enterobacterالاحماض. جمي__ع ان__واع

تق____ومAeromonas و Bacillus و Erwiniaالى اجن____اس من بذلك.

انتاج هذه المنتجات النهائيه الغير حامضيه تؤدي الىMR-VPتقلي___ل في حموض___ية وس___ط brothقل___ه في(

( مؤدي__ه الى النتيج__ه الس__لبيه بلنس__بهpHانخفاض ال_ (. لس__ء الح__ظ ليس هن__اكMRلفحص احمر المثي__ل ) )(، م__ع ذل_ك ف_انButanediol,__ 2,3اختب__ار للكش__ف عن )

Acetoin )acetylmethylcarbinol( ___احد المركب__ات الاولي__ه لل 2,3 __,Butanediolيمكن ببساطه تحديده والكش__ف عن__ه )

Barritt’sبواس__طة كاش__ف ب__ارييت reagentمك__ون من( alpha Naphthol و KOH عن__د تلقيح وس__ط ،)MR-VP broth

بالبكتريا ولمدة ثلاث__ة اي__ام نق__وم باض_افة الكاش_ف ، سيتحول لون الوسط الى اللون ال__وردي البيرغن__دي

(Pink-Burgundy) _دلاله على الفحص الموجب لل VP.

الموادMR-VP broth

4

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

E. coli and Enterobacter aerogenes or Klebsiella cultureBarritt’s reagent )Voges-Proskauer( Indicator قط__ره من محل__ول الكش__ف18 م__ل( 0.5يضاف )

الى الوسط الملقح الحاوي على(alpha naphthol)الاول مل من الزرع ، ثم يضاف كميه مساويه للكاش__ف1

الى نفس الانبوب__ه،(KOH)الاول من الكاش__ف الث__اني يعتبر مهم جدا وذلك لغرضترج الانبوبه بقوه ))

ثانيه حتى تحول لون الوسط الى20(( كل التهويهالاحمر الغامق او الوردي

فحص استهلاك الستراتCitrate Utilization

Enterobacterقابلي___ة بعض الاحي___اء المجهري___ه مث___ل

aerogenes و Salmonella typhimuriumعلى اس______تهلاك السترات كمصدر وحيد ورئيسي للك__اربون يمكن ان يعت__بر مفي__د ج__دا في عملي__ة التفري__ق بين البكتري__ا

المتواجده في امعاء الانسان.

Koser’s)وس__ط الس__ترات بنوعي__ه citrate medium and Simmons citrate agar) يمكن ان يس__تخدم في عملي__ة

الكشف عن قابلية البكتريا في اس__تهلاك الس__ترات. Sodium Citrateفي كلا الوسطين ، مادة ال_

تعت___بر المص___در الرئيس___ي للك___اربون والني____تروجين يجه____ز بواس____طة املاح

Ammoniumالاموني_____وم saltsب_____دلا من الاحماض الامينيه . يح__وي الوس__ط على

Bromthymol blueوال__ذي ل__ه دور مهم في تحوي__ل ل__ون الوس__ط الى الازرق عن__د

. عن__د تلقيح الوس__طpHارتف__اع قيم_ة ال_ ساعه بدرجة24بالبكتريا وحضنها لمدة

5

Citrate -

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

(Enterobacter aerogenesم، في النتيج___ة الايجابي___ه )37Prussianنلاحظ ل__ون ازرق بروس__ي )ازرق داكن( blue

color. فحص تحلل اليورياUrea Hydrolysis منUreaseيعتبر انتاج انزيم اليوريز

الخص___ائص المهم___ه في تفري___ق البكتري__ا المعوي__ه. يق__وم الان__زيم بشطر جزيئة اليوري__ا الى الاموني__ا،

Proteusتعت__بر vulgaris, Providencia, and

Morganellaمن الاجن____اس المنتج____ه لانزيم اليوريز. وسط اليوري_ا يعت_بر

البفريه الوساط Buffered solutionمن المنتج___ه من خلاص___ات الخم___ائر بالاض__افه الى اليوري__ا. كم__ا يح__وي

Phenolعلى ال_ red _كمحدد لل pHبم__ا ان اليوري__ا غ__ير . مس__تقره وتتحطم في الاوتوكلي__ف عن__د التعقيم ل__ذا تعقم بواس___طة الترش___يح ثم تض___اف الى الوس___ط المعقم. عند اف__راز الي__وريز في الوس__ط الملقح من قب__ل البكتري__ا ف__ان الموني__ا المنش__طره من اليوري__ا

. وبس__ببpHبواسطة الان__زيم س__وف ترف__ع قيم__ة ال_ Phenol فان pHالقيمه العاليه لل_ redيتغير من الاص__فر

.Cerise Red colorالى الاحمر الكرزي Triple السكر الثلاثي الحديدي فحص

Sugar Iron (TSI)او

Kligler's كلكلر الحديدي فحص Iron agar (KIA)

6

Urea -

Urea +

Urea ++

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

( من الفحوص____ات المس____تخدمهKIA( و )TSIيعت____بر ) H2Sللكش__ف عن التخم__ر الكاربوهي__دراتي وانت__اج ال_

في البكتريا المعويه. هذه الاوساط تمتلك العديد من الم___واد الاولي___ه ال___تي تس___تطيع البكتري___ا المعوي___ه اس__تهلاكها متض__منة ع__دة ان__واع من الكاربوهي__درات والبروتينات اض__افة الى الثايوس__لفات. اعتم__ادا على ن__وع الم__واد المس__تخدمه في عملي__ة التخم__ر يمكن تفريق البكتريا المعويه. كلا الوس__طين يحوي__ان على

Beefخلاصة لحم البقر والخم__ائر Extract و Yeast Extract والببتون.

هيTSIالس____كريات القابل____ه للتخم____ر في وس____ط و الس___كروزLactose ، اللاكت___وز Glucose))الكلوك___وز

Sucrose الس__كريات القابل__ه للتخم__ر في وس__ط .))KIA ((. يعت___برLactose و اللاكت___وز Glucoseهي ))الكلوك___وز

Sodium Thiosulfateالمص__در الوحي__د للس__لفات لغ__رض Ferrous. كلا الوس__طين يحي__ان على H2Sانت__اج Sulfate

لتك__ون الترس__ب الاس__ود فيH2Sوالتي تتفاع__ل م__ع قعر الانبوبه . الكاشف الموج__دود في كلا الوس__طين

Phenol هو pHلل_ Red يعطي .Phenol Redلون احمر عن__د pH 7.4و ل__ون اص__فر في الوس__ط الحامض__ي ول__ون

احم__ر ق__اتم في الوس__ط القاع__دي. تلقح الاوس__اط بواس__طة الطعن الى اس__فل الانبوب__ه ثم التخطي__ط

على السطح.Interpretation of Enterobacteraiceae reactions on Kligler’s

iron agar (KIA)InterpretationReaction

Only glucose fermentedAcid butt )yellow( and alkaline slant )red(Glucose and lactose fermentedAcid throughout medium )butt and slant

yellow(Neither glucose nor lactose fermentedAlkaline throughout medium )butt and

7

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

slant red(Gas-producing bacteriaGas bubbles in butt or cracks in the

mediumHydrogen sulfide )H2S( producedBlackening in the butt

Typical reaction patterns of Enterobacteraiceaeon Kligler’s iron agar (KIA)

Bacteria speciesSugar)s( fermentedReactionEscherichia coli - Klebsiella

Enterobacter - Citrobacter diversusSerratia liquefaciens

Glucose: acid and gasLactose: acid and gas

Gas Forming

Butt acidSlant acidGas in butt

No H2S

Salmonella - ProteusCitrobacter freundii

Glucose: acid and gasLactose: No fermented

Gas Forming

Butt acidSlant alkalineGas in butt

H2S productionShigella - Yersinia

Serratia marcescensProvidencia stuartii - Providencia

rettgeri

Glucose: acid onlyLactose: No fermented

No Gas Forming

Butt acidSlant alkaline

No GasNo H2S

Salmonella paratyphi AHafnia alvei

Serratia marcescensMorganella morgani

Glucose: acid and gasLactose: not fermented

Gas Forming

Butt acidSlant alkalineGas in butt

No H2SAlcaligenes

PseudomonasAcinetobacter

No sugars fermentedButt neutral/alkaline

Slant alkalineNo GasNo H2S

Tube e

Tube d

Tube c

Tube b

Tube a

AAAK-SlantAAAK-Butt-+---Gas--+--H2S

8

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

Litmus حليب اللتموس فحص Milk ReactionsSkim% من 10يح____وي حليب اللتم____وس على Milk

وكميات قليله من اللتموس )تعتبر ك__دليل على تغ__يرpH( عند تحض__ير الوس__ط يك__ون ال_ pHال_ . تعت__بر6.8

هذه الدرجه من الحموضه ممتازه وملائمه جدا لنم__و العدي___د من الاحي___اء المجهري___ه ويمكن ان يعت___بر مس__اعدا ج__دا في عملي__ة التش__خيص. بالاض__افه الى الى ذلك : لمعرف__ة وج__ود او ع__دم وج__ود تخم__ر في الوس___ط يمكن من خلال___ه معرف___ة نش___اط بعض الخصائص الانزيمي__ه البروتيني__ه للبكتري__ا. العدي__د من البكتريا الاختياريه التي تملك خاصيه الاختزال القوي

(Strong Reducing Powersاللتموس استهلاك تتمكن من ) كب__ديل لاس__تقبال الالكترون__ات مؤدي__ه لتغ__ير ل__ون

م37 اي__ام وبدرج__ه 5-4الوسط. يحتاج التفاعل الى ساعه.24لكي يكتمل مع مراقبته كل

التفاعلات : يصبح اللتموسAcid Reactionالتفاعل الحامضي .1

وردي اللون وهو مثالي للتخمر البكتيري.Alkalineالتفاع___ل القاع___دي .2 Reactionيتح___ول :

اللتم__________وس الى الازرق او البنفس__________جي الفاتح.العديد من البكتريا ذات النش__اط المحل__ل

24للبروتين__ات تس__بب ه__ذه الظ__اهره خلال ال_ ساعه الاولى.

Litmusتفاع___ل اللتم___وس .3 Reductionالوس___ط : ال___زرعي يتح___ول الى الل___ون الابيض بس___بب

استهلاك الاوكسجين اثناء تكاثر البكتريا.Coagulationتكوين الخث__اره .4 Curd formationتص__لب :

الوس__ط نتيج__ة تخ__ثر ال__بروتين ، ام__ل انبوب__ة9

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

لتشاهد فيم__ا اذا ك__ان هن__اك°45الاختبار بزاويه تخثر او لا.

: Peptonizationالببتنه .5 يصبح الوسط نصف ش__فاف وغالبا ما يعطي لون رمادي على السطح بسبب

البكتريا ذات النشاط المحلل للبروتينات. : تكوين نمو كثيف لزج في قعرRopiness اللزوجه.6

الانبوبه.

Growth النمو على الاوساط الزرعيه on Cultural Media

اولا/ وسط الماكونكيMacConkey agar

يعت__بر من الاوس__اط التفريقي__ه حيث تظه__ر بكتري__اEscherichia coliعلى شكل مستعمرات ص__غيرة وردي__ة

10

فحص حليب اللتموس Litmus milk reactions

)A( Alkaline. )B( Acid. )C( Upper transparent portion is Peptonization solid white portion in bottom is coagulation and litmus reduction; overall redness is

interpreted as acid. )D( Coagulation and litmus reduction in lower half; some Peptonization )transparency( and acid in top portion. )E( Litmus indicator is

masked by production of soluble pigment )Pseudomonas(; some Peptonization

A B C D E

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

Klebsiellaام_______ا بكتري_______ا

مس__تعمرات بيض__وية وردي__ة ذات مرك__ز غ__امق بع__د م ويح__وي ه__ذا37 س__اعة بدرج__ة 24ف__ترة حض__انة

الوسط املاح الصفراء كمانع لنمو البكتري__ا الموجب__ةSerratiaلصبغة غ__رام. ام__ا بكتري__ا marcescens فتك__ون

فتك__ون ذات Pseudomonasباهتة اللون رماديه ، اما ال نمو غير منتظم وشفافه.

Eosin Methylin ثانيا/ وسط الايوسين مثيلين الازرق Blue media )EMB(

يعت__بر من الاوس__اط التفريقي__ه حيث تظه__ر بكتري__اEscherichia coliعلى ش__كل مس__تعمرات ص__غيرة ذات

Greenلون ازرق مخضر لماع مع__ني Metallic Shineفي . تك__ون مس__تعمرات وردي__ةKlebsiella aeruginosaحين ان

مخاطية ونادرا ما تمتلك بريق معدني. – Salmonella ثالثا/ وسط السالمونيلا - الشيكيلا

Shigella agar )S-S agar(

11

البكتريا المرضيه والفيروساتالعملي

المختبر الثالثعشر والرابع عشر

يعتبر هذا الوسط من الاوساط المهمه لع__زل بكتري__اSalmonella و Shigellaحيث تظه________ر مس________تعمرات

السالمونيلا بلون رم__ادي وتك__ون نهاي__ات النم__و ذات.H2Sلون داكن اسود بسبب ترسب الثايوسلفات

Nutrient agar رابعا/ وسط الاكار المغذي يعتبر من الاوس__اط العام__ه ال__تي تنم__و عليه__ا تقريب__ا جميع انواه البكتريا )الموجبه والسالبه لصبغة كرام ، الهوائيه واللاهوائيه حسب ظ__روف الحض__ن(. تظه__ر الانواع البكتيريه على وسط الاكار المغذي باش__طال

Serratiaوال___وان مختلف___ه، حيث تظه___ر مس___تعمرات

marcescens بلون احمر مميز بينم__ا يك__ون نم__و بكتري__ا Pseudomonas مميزا بسبب تكوينها للص__بغات Pyocyanin

)وال__تي تك__ون خض__راء مص__فره(. ام__ا نم__و بكتري__اKlebsiellaفيك____ون مم____يزا بلزوجت____ه حيث تك____ون

المستعمرات الناميه مخاطية التكوين. Chromedia agar رابعا/ وسط الاكار الملون

يعتبر من الاوس__اط العام__ه ال__تي تنم__و عليه__ا تقريب__ا جميع انواه البكتريا )الموجبه والسالبه لصبغة كرام ، الهوائيه واللاهوائيه حسب ظ__روف الحض__ن(. تظه__ر الانواع البكتيريه على وسط الاكار المغذي باش__طال

والوان مختلفه،.

12