IRASM · calcul automat efectuat de softul Sherlock care exprima ... orice serii de caracteristici (ex. concentratii procentuale ale acizilor grasi) caracterizeaza grupul

IRASMCentrul de Iradieri Tehnologice Laboratorul de Microbiologie

Identificarea microrganismelor patogene prin analiza acizilor grasi celulari

– Metoda MIDI –

Eva-Ruxandra ALMAJAN

Marian VIRGOLICI

Workshop BIOM

- 9 februarie 2007 -

IRASMCentrul de Iradieri Tehnologice

Laboratorul de Microbiologie

SCOP

Identificare si caracterizare microbiologica la nivel de specie pe baza spectrului de acizi grasi membranari.

Detectia unor microorganisme specifice cerute de Farmacopeea Europeana sau alte standarde specifice.

http://www.shutterstock.com/subscribe.mhtml



Utilizari

Domenii care utilizeaza Metoda Midi:

Diagnostic clinic

Epidemiologie

Microbiologie alimentara

Bioterorism

Entomologie

Bioremediere

Studii de taxonomie

Biologia marina

Cercetari medicale

Patologia plantelor

Stiintele solului

Calitatea apei

Controlul calitatii in domeniul farmaceutic




Au fost identificati peste 300 de acizi grasi la nivelul membranelor celulare microbiene.

Principiul metodei

Compozitia acizilor grasi la nivel de specie in conditii bine determinate este stabila, bine conservata si arata un mare grad de omogenitate in cadrul diferitelor grupuri taxonomice, ceea ce a permis realizarea unor biblioteci.



Pentru a putea analiza profilul de acizi grasi sunt necasari urmatorii pasi:

• microorganismul trebuie izolat in cultura pura,

• se recolteaza masa celulara care este supusa unui protocol chimic (saponificare, metilare, extractie cu solvent organic, spalare bazica)

• esterii metilici ai acizilor grasi omologi rezultati sunt masurati prin cromatografie de inalta rezolutie in faza gazoasa.

• compozitia obtinuta sub forma de cromatograma este comparata cu o baza de date (biblioteca cromatografica)


Principiul metodei



Profilul de acizi grasi este stabil fata de:

• Prezenta sau absenta plasmidelor in populatia de

microorganisme

• Mutatii


Principiul metodei




Principiul metodei

Profilul de acizi grasi variaza in functie de:

• Mediul de cultura – in functie de biblioteca

cromatografica folosita, se utilizeaza un mediu de

cultura cu o compozitie bine definita.

• Temperatura de incubare – este bine determinata,

nefiind acceptate variatii mai mari de 1° C.

• Varsta fiziologica – stabilitatea cea mai mare a

profilului de acizi grasi este obtinuta in faza de

crestere exponentiala tarzie.



Pentru a obtine varsta fiziologica dorita, sunt importante:

• Tehnica de insamantare folosita – este recomandata obtinerea a patru cadrane

• Perioada de incubare – in general 24 h

• Experienta microbiologului la recoltare


Principiul metodei




Fluxul probei

Microorganismul de analizat (proba) este izolat in

cultura pura, cultivat pe mediul specific si incubat la

temperatura necesara in cadrul Laboratorului de

Microbiologie.

Recoltarea si procesarea chimica a masei celulare

recoltate din cultura se realizeaza in camera de clasa C

din Zona de Camere Curate a Laboratorului de

Microbiologie.

Rularea la gaz cromatograf are loc in Laboratorul de

Analize Fizico-chimice.




Interpretarea rezultatelor

Rezultatul analizei este reprezentat de specia sau speciile microbiene din biblioteca folosita care reprezinta cele mai probabile identificari.


Asemanarea este cuantificata prin Indicele de Similaritate (SI), valoare numerica obtinuta in urma unui calcul automat efectuat de softul Sherlock care exprima distanta in spatiu multidimensional (distanta euclidiana) intre profilul cromatogramei microorganismului necunoscut si cel mai asemanator profil al cromatogramei unei specii din biblioteca.Astfel SI nu este o probabilitate sau un procent ci o expresie a distantei relative fata de media populatiei respective.







SI presupune ca speciile de microorganisme au o distributie gausiana normala si ca media populatiei in orice serii de caracteristici (ex. concentratii procentuale ale acizilor grasi) caracterizeaza grupul.





Se folosesc urmatoarele recomandari pentru interpretarea SI:

• Probele cu un SI de 0.500 sau mai mare si cu o diferenta intre prima si a doua identificare de 0.100 sau mai mare sunt considerate identificari bune

• Daca SI este cuprins intre 0.300 si 0.500 si bine separate de a doua optiune (> 0.100), poate fi vorba de o identificare buna, dar o tulpina atipica.

• Valori mai mici de 0.300 sugereaza ca specia nu se gaseste in biblioteca, dar softul va indica cele mai apropiat inrudite specii.




Limitarile metodei

1. Microorganisme evoluate in aceeasi nisa ecologica

Exemplu: Enterobacteriaceae

2. Microorganisme care nu se gasesc in biblioteca

3. Standardizarea conditiilor de cultura




Extractia chimica a acizilor grasi membranari – Metoda MIDI -

Celulele recoltate sunt transferate in tuburile de extractie

RecoltareAnsa Tub de

extractie

Reactia de metilare

Reactia de saponificareNaOH solutie apa : metanol

solutie metanolica de HCl




Extractia chimica a acizilor grasi membranari – Metoda MIDI -

Extractia lichid-lichid

Spalarea extractului

Solventi de extractie

n-Hexan,

Metil tert-butil eter

NaOH

solutie apoasa



Configuratia Cromatografului de Gaze pentru – Metoda MIDI -

• Injectie: Robot Autosampler

• Vaporizare: Injector split/splitless clasic

• Separare:

Coloana cromatografica capilara Agilent Ultra 2

(faza stationara : fenil metil siloxan)

Program de temperatura pentru separarea analitilor

(esterii metilici ai acizilor grasi omologi)

• Detectie : Detector de Ionizare in Flacara (FID)

(neselectiv)





Principiul detectiei acizilor grasi – Metoda MIDI -

• Detectia analitilor este nespecifica, iar semnalul obtinut este proportional cu concentratia.

• Controlul electronic al pneumaticii permite un debit constant al gazului purtator pe coloana si implicit elutia (retentia) reproductibila a analitilor, astfel:

Softul identifica automat analitii pe baza timpilor de retentie

Concentratiile relative ale acizilor grasi astfel identificati sunt comparate cu baza de date si se raporteaza automat potrivirile in ordinea indicilor de similaritate.



Softul de identificare microbiana Sherlock

Soft Analiza/Interpretare automata: Sherlock

• comanda prin programe “macro” softul de control si achizitie al cromatografului “Chemstation”;

• prelucreaza automat datele obtinute din Chemstation si le compara cu baza de date existenta;

• asigura calitatea rezultatelor obtinute prin functii de evitarea erorilor cromatografice si sau de preparare a probelor (extractie).





• Verificarea periodica a stabilitatii timpilor de retentie si a factorului de corectie al raspunsului detectorului in functie de concentratia analitului prin etalonarea cu un amestec etalon de esteri metilici ai acizilor grasi C9 – C20 cu concentratii cunoscute.

• Verificarea controalelor negative (blanc) cu praguri de semnalare la prezenta unor impuritati interferente.

• Verificarea / Diagnosticarea integritatii sistemului cromatografic cu sugerarea unor solutii.

• Verificarea cantitatii de proba injectate prin compararea raspunsului total al detectorului cu un domeniu optim.

• Verificarea cantitatii de celule prelevate pentru extractie prin compararea raspunsului total al analitilor cu un domeniu optim.

Controlul calitatii – Metoda MIDI “Built-in” in softul Sherlock




Controlul calitatii – Metoda MIDI

Pentru fiecare lot de probe necunoscute se utilizeaza :

• blanc (fara celule) care va fi procesat odata cu restul probelor in aceleasi conditii ;

• Microorganisme de control pozitiv:- Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13637- Altele in functie de libraria de microorganisme utilizata si microorganismele sugerate pentru validare de catre producator.

Microorganismele de referinta vor fi inoculate, incubate si recoltate in acelasi lot si conditii cu cele necunoscute.

La interpretarea rezultatelor se verifica rezultatele etalonarii, controalelor pozitive si negative si tabelul cu parametrii de peformanta ai metodei.




• Dezvoltarea si Validarea primara a metodei precum si determinarea parametrilor de performanta ai metodei a fost realizata de catre producator.

• Metoda este detaliata complet referitor la conditiile necesare de operare, materialele, instrumentarul si echipamentele necesare si rezultatele asteptate, precum si interpretarea lor.

• Validarea primara realizata de producator acopera:- Prepararea probei (microorganismelor); - Tipul raspunsului obtinut;- Specificitatea raspunsului obtinut;- Concentratia minim detectabila;- Linearitatea raspunsului obtinut;- Acuratetea si Precizia raspunsului obtinut;- Robustetea metodei; - Limitarile metodei.

Validare – Metoda MIDI VALIDARE PRIMARA - MIDI, Inc.




Validare utilizator• Dovedeste ca rezultatele obtinute cu aparatele, instrumentarul, reactivii, analistii si in conditiile laboratorului sunt corecte.• De asemenea se verifica incadrarea parametrilor de performanta ai metodei in domeniile determinate de producator in timpul validarii primare.

Validarea pentru utilizarea intentionata• Se face cu o serie de microorganisme de referinta ATCC de interes pentru librarie si domeniul de interes al laboratorului si se va demonstra ca se obtin rezultate reproductibile si robuste.• Concomitent se va face pe un numar semnificativ de probe reale confirmand rezultatele cu metode alternative si dovedind de asemenea reproductibilitatea si robustetea rezultatelor.

Validare – Metoda MIDI VALIDARE UTILIZATOR





1. Selectivitate / Specificitate

a) Identificarea analitilor in cromatograma;

b) Contributiile interferentilor - informatii matrice : mediu de cultura (control negativ).

2. Precizie

a) Repetabilitate (sistemul cromatografic);

b) Reproductibilitate (intreaga metoda).

3. Liniaritate (raspunsul detectorului~concentratia analitilor)

4. Exactitate

Identificarea tuturor microorganismelor recomandate de producator pentru validare si a tulpinilor de referinta de interes pentru utilizarea intentionata.





5. Robustete

Variatii intentionate ale parametrilor operationali in limitele de etalonare ale instrumentarului, echipamentelor si specificatiilor producatorului MIDI, Inc. :

- Mediu de cultura;

- Temperatura de incubare ;

- Volumul/masa de celule prelevate;

- Timpul de stocare a celulelor la frigider pana la extractie;

- Concentratiile solutiilor reactivilor de extractie;

- Temperaturile bailor de apa;

- Numarul maxim de probe procesate in acelasi timp(lot).




Metoda MIDI Avantaje

• Timp scurt de obtinere a rezultatului 24-72 ore ; Preincubarea este necesara dar extractia si identificarea sunt mult mai rapide decat in cazul metodelor biochimice si prin urmare rezultatul este obtinut mai rapid.

• Microorganismul este distrus dupa prima etapa a procesarii chimice.

• Identificarea poate fi mai precisa decat in cazul metodelor conventionale microbiologice bazate pe profilele metabolice ale microorganismului.

• O baza de date mare si variata de microorganisme pentru aceeasi metoda.

• Numar mare de probe procesate simultan.

• Grad ridicat de standardizare al analizei.




Metoda MIDI

Bibliografie:

Sherlock Microbial Identification System, MIS Operating Manual, November 2005, MIDI, Inc.

MIS whole cell fatty acid analysis by gas chromatography, Training Manual, Ed. by Ralph Paisley, Ph.D. , 2004, MIDI, Inc.

European Pharmacopeea 5.0, 5.1.6. Alternative methods for control of microbiological quality.


Documents

IRASM · calcul automat efectuat de softul Sherlock care exprima ... orice serii de caracteristici (ex. concentratii procentuale ale acizilor grasi) caracterizeaza grupul