РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ ПОСТНАТАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА КСЕНОГЕННЫМИ ИММУННЫМИ ГЛОБУЛИНАМИ

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VI, № 4, 2011

Оригинальные исследования34

костного мозга. Разработка таких препаратов весьма

актуальна, учитывая то, какими быстрыми темпами

нарастает использование клеточных технологий в

терапии обширного спектра заболеваний. В Россий-

ском НИИ гематологии и трансфузиологии разра-

ботано и экспериментально апробировано средство

для активации процессов пролиферации и диффе-

ренцировки CD34+ стволовых кроветворных клеток

[11]. Указанное средство является ксеногенными

иммунными глобулинами, направленно действующи-

ми на весь комплекс детерминант на поверхности и

внутри гемопоэтических стволовых клеток, что при-

водит к их активации. На основании данных экспери-

ментальных исследований на животных и изучения

препарата в условиях культивирования CD34+ ство-

ловых кроветворных клеток человека in vitro нами

получены факты, свидетельствующие о способности

антител к стволовым кроветворным клеткам стиму-

лировать их пролиферацию и дифференцировку.

Несмотря на то, что материал культуральных ис-

следований носит предварительный характер, его опу-

бликование целесообразно. Исследования будут про-

должены с целью получения данных необходимых для

статистического анализа и оценки специфичности.

Клинические и экспериментальные данные ис-

следований с использованием метода клеточной

терапии постнатальными стволовыми клетками

костного мозга гематологических [1, 2], сердечно-

сосудистых [3–5], онкологических [6, 7], невроло-

гических [8] заболеваний, а также травм и других

патологических состояний [9, 10] свидетельствуют,

в значительном числе случаев, о достижении по-

ложительного результата. Одновременно при этой

же методике регистрируется большое количество

отрицательных результатов, как при использовании

аллогенных стволовых клеток, причем при отсут-

ствии признаков иммунологического отторжения,

так и при введении аутогенных стволовых клеток.

В таких ситуациях основной причиной неудач клеточ-

ной трансплантации является недостаток или полное

отсутствие факторов, регулирующих функциональ-

ное состояние стволовых клеток, в связи с чем ста-

новится невозможным выход клетки из состояния

покоя и запуск генетически детерминированного

пролиферативного и дифференцировочного потен-

циала. Одним из возможных путей устранения таких

состояний является введение субстанций, регули-

рующих развитие стволовых кроветворных клеток

e-mail: [email protected]

Регуляция развития постнатальных стволовых клеток костного мозга ксеногенными иммунными глобулинами направленного действия

Е.А. Селиванов, В.И. Ругаль

Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА, Санкт-Петербург

Regulation development of bone marrow postnatal stem cells by specific xenogenic immune globulinsE.A. Selivanov, V.I. Rugal Russian Research Institute of Hematology and Transfusiology, Saint-Petersburg

Показана возможность стимуляции развития стволовых

кроветворных клеток ксеногенными иммунными глобулина-

ми, направленно действующими на CD34+ стволовые клет-

ки. Эффективность подтверждена в экспериментальных

исследованиях на животных с цитостатистической гемо-

иммунодепрессией и при культивировании in vitro CD34+

стволовых кроветворных клеток человека. Животные,

получавшие специфические иммунные глобулины восста-

навливали гемопоэз и иммунитет к 30 сут. наблюдения,

в контрольной группе регенерация гемолимфопоэза проис-

ходила по истечении 60 сут. In vitro более, чем на 30%

увеличивалась колониеобразующая способность стволо-

вых кроветворных клеток при добавлении в среду антител

к CD34+ стволовым клеткам. Наши предварительные дан-

ные свидетельствуют о способности ксеногенных антител к

мультипотентным мезенхимальным стромальным клеткам

стимулировать их дифференцировку в остеобласты и эн-

дотелиоциты – ключевые клеточные элементы, формирую-

щие нишу стволовых кроветворных клеток.

Ключевые слова: стволовые клетки, регуляции, ксено-

генные иммунные глобулины направленного действия.

The regulation development of haemopoietic stem cells by

rabbit anti-human CD34+ stem cells immune globulin has been

established. It was showed by experimental investigation on

rats with cytostatic haemo-immunosuppression and in culture

human CD34+ stem cells. Thus, in animals which received

anti-CD34+ immune globulin the recovery of blood and

immunity values occurred earlier than in the control animals.

The experimental animals recovered haemolymphocytopoiesis

after one month while control group normalized haemopoietic

function after two months. In vitro colony-forming ability

human haemopoietic stem cells are increased in 30 per cent

by the addition specific CD34+ immune globulin in counditioned

medium. Our preliminary date suggest that rabbit anti-human

mesenchymal stem cells immune globulin can stimulate the

differentiation of mesenchymal cells in osteoblasts and

endotheliocytis the cells that form haemopoietic niche.

Key words: stem cells, regulation, antibodies.

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ


Оригинальные исследования 35

но, трехкратно вводился физиологический раствор.

В статье приведены данные с использованием физи-

ологического раствора, поскольку они не отличались

от показателей животных, получавших иммуногло-

булины не иммунизированных животных. Действие

препарата оценивалось по показателям крови на 1,

7, 15, 24, 30 и 60-е сут. после завершения экс-

перимента. Пролиферативная активность CD34+

стволовых клеток изучена in vitro с использованием

культуральной системы «агаровый квадрат». Цифро-

вой материал обрабатывался методами непараме-

трической статистики с определением критерия «U»

по Вилкоксон – Манн – Уитни.

Результаты и обсуждение

В экспериментальных исследованиях на живот-

ных эффективность влияния анти-CD34 иммуно-

глобулина на регенерацию костного мозга крыс с

миелодепрессией, вызванной цитостатическими

препаратами, анализировали по динамике восста-

новления показателей периферической крови. Ре-

зультаты исследований представлены в таблице 1.

Материал и методы

Субстанция, регулирующая развитие стволовых

кроветворных клеток, получена на основе ксеноген-

ных иммуноглобулинов, выделенных из крови кроли-

ков, иммунизированных CD34+ стволовыми клетка-

ми человека [11]. Препарат изучен в эксперименте

на модели цитостатической гемо-иммунодепрессии.

Эксперименты, выполнены на 70 крысах-самцах ли-

нии Вистар массой 160–200 г. Животных содержа-

ли при свободном доступе к воде и пище. Опытную

и контрольную группы составили по 35 животных

в каждой. В обеих группах гемо-иммунодепрессия

вызывалась пятикратным, с интервалами в 24 ч,

внутрибрюшинным введением циклофосфана в дозе

10 мг/кг, рубомицина 2 мм/кг, и преднизолона 2 мг/кг

в 3 мл физиологического раствора. На следующие

сутки после окончания введений гемоиммунноде-

прессивных препаратов животным опытной группы

внутрибрюшинно, трехкратно, также с интервалом

в 24 ч, вводился препарат в дозе 0,1 мг/кг, в том

же объеме физиологического раствора. Животным

контрольной группы в те же сроки внутрибрюшин-

Таблица 1. Влияние анти CD34+ иммуноглобулина на показатели крови у крыс с экспериментальной гемо-иммунодепрессией

Эритроциты1012/л

Лейкоциты109/л

Лимфоциты%

Т-лимфоциты%

В-лимфоциты %

Контрольная группа (n = 35)

Исходные данные 5,57±0,13 10,8±0,4 71,0±2,7 13,1±1,9 48,6±3,7

После 5-кратного введения химиопрепаратов

3,40±0,79* 2,9±1,3* 53,6±7,6* 2,0±0,3* 18,7±2,4*

1-е сут. после введения физраствора

3,82±1,12 3,3±1,3* 56,4±3,3* 3,6±0,3* 7,3±1,7*


3,39±1,15 4,7±1,6* 64,0±2,9 2,2±0,9* 3,5±1,0*


5,32±1,57 3,0±0,5* 62,6±5,1 3,4±0,2* 14,5±6,3*


6,46±1,0 4,4±1,8* 82,0±5,2 6,2±1,8* 20,3±4,1*


6,60±0,46 3,5±0,3* 82,0±1,6 7,4±0,2* 13,9±8,6*

Опытная группа (n = 35)

Исходные данные 5,24±0,18 9,9±0,7 73,1±1,9 11,9±2,4 47,8±4,0

После 5-кратного введения химиопрепаратов

3,18±0,64* 2,7±0,8* 52,1±6,7* 1,9±0,5* 17,1±2,4*

1-е сут. после введения иммуноглобулина

4,17±0,70* 5,0±0,9* 70,0±8,0** 28,7±5,5** 65,8±16,2**


7,39±0,67** 5,3±1,4* 56,4±3,5** 32,8±15,8** 59,6±14,5**


9,25±0,93** 4,9±0,9* 80,2±7,4** 13,4±1,2** 22,7±3,4*


8,64±1,91* 6,8±0,9* 72,8±6,2 21,8±4,6** 49,1±15,8**


8,86±1,31** 8,7±1,1** 76,4±1,1 16,4±1,1** 45,0±1,5**

Примечание: * – р < 0,05 по сравнению с исходными данными; ** – р < 0,05 по сравнению с контролем.



тации стволовых кроветворных клеток пуповинной

крови минимальная эффективная доза для реципи-

ента с массой тела не менее 10 кг составляет 5×108

клеток, а для реципиента с массой тела более 50 кг,

она составляет 25×108 клеток и более [12]. Дозо-

зависимость указанной процедуры вызывает необхо-

димость получения большого количества стволовых

клеток, а в случаях ограничения их количества, дик-

тует необходимость использования искусственных

регуляторных факторов, стимулирующих их проли-

феративную активность в организме реципиента.

В тех случаях, когда трансплантация стволовых кле-

ток осуществляется в условиях нарушения регуля-

торной функции микроокружения, использование

экзогенных регуляторов развития стволовых клеток

является единственным способом, позволяющим ак-

тивировать генетическую программу пролиферации

и дифференцирования стволовых клеток. Одним из

таких экзогенных регуляторов могут быть изученные

нами ксеногенные поликлональные иммуноглобули-

ны класса IgG с молекулярной массой 150 кД, содер-

жащие 65–85% иммуноглобулина IgG1, 23–30%

иммуноглобулина IgG2, 0,00001–8,0% иммуно-

глобулина IgG3 и 0,00001–4,0% иммуноглобули-

на IgG4, полученные как гуморальный иммунный

ответ на поверхностные и внутриклеточные антигены

CD34+ стволовых клеток.

Выработанные как результат гуморального иммун-

ного ответа на весь комплекс антигенов стволовых

клеток указанные гликопротеины целенаправленно

стимулируют процессы жизнедеятельности стволо-

вых клеток, в первую очередь, активируя синтез ДНК

в ядрах стволовых клеток и, как следствие, вступле-

ние этих клеток в митотический цикл, что обеспе-

чивает образование дополнительных родоначальных

кроветворных клеток.

Учитывая дозозависимый эффект трансплантаций

гемопоэтических стволовых клеток, использование

иммуноглобулинов направленного действия может

способствовать снижению количества вводимых

стволовых клеток. Кроме того, использование анти-

тел может привести к положительному эффекту в тех

случаях, когда в силу ряда причин не имеется необхо-

димого для полноценной трансплантации количества

стволовых клеток. В таких условиях, вследствие сти-

муляции пролиферативных процессов масса стволо-

вых клеток под воздействием иммуноглобулинов

будет увеличиваться, достигая объемов, обеспе-

чивающих полноценную регенерацию гемопоэза.

Введение цитостатических препаратов приводи-

ло к снижению показателей крови и иммунитета к

моменту начала терапии в 3–6 раз, по сравнению с

исходным уровнем. При этом животные обеих групп

были способны восстанавливать их до нормальных

величин. Однако процессы регенерации костного

мозга с восстановлением показателей перифери-

ческой крови протекали по-разному. Трехкратные

внутрибрюшинные инъекции антиCD34+ иммуногло-

булина способствовали ускорению этих процессов

примерно в 2 раза, о чем свидетельствовало вос-

становление показателей крови животных опытной

группы к 30-м сут., в то время как эти показатели у

животных контрольной группы приходили к нормаль-

ным значениям только на 45–60-е сут.

Специфическая активность антител к CD34+ ство-

ловым клеткам подтверждена в исследованиях in

vitro. В таблице 2 представлены данные о колоние-

образующей способности клеток-предшественниц

костного мозга при их культивировании in vitro.

Клетки-предшественницы гемопоэза больных

острым лимфобластным лейкозом (наблюдение А),

апластической анемией (наблюдение Б) и доно-

ра крови (наблюдение В) инкубировали в течение

14 дней в культуральной системе, с добавлением

в кондиционную среду ксеногенных иммуноглобу-

линов. В контрольные образцы, в тех же дозах –

иммуноглобулины неиммунных кроликов. Получен-

ные результаты свидетельствуют о том, что антиCD34

иммуноглобулины в указанных концентрациях оказы-

вают стимулирующее действие на пролиферативную

активность стволовых кроветворных клеток костного

мозга, увеличивая более чем на 30%, по сравнению

с контролем, число выросших клеточных агрегатов.

Такие же количества иммуноглобулинов неиммунных

кроликов не влияли на рост стволовых гемопоэти-

ческих клеток. Предварительные данные свидетель-

ствуют, что преинкубация с клетками человека при-

водит к угнетению активности субстанции.

Таким образом, представленные эксперименталь-

ные данные in vivo и in vitro свидетельствуют о воз-

можности использования гликопротеинов направлен-

ного действия в качестве субстанции, регулирующей

функциональные свойства стволовых клеток.

Как указывалось выше, стволовые клетки кост-

ного мозга человека используются в современной

медицине при лечении многих заболеваний и пато-

логических состояний. Эффект от трансплантации

стволовых клеток дозозависим. Так, при трансплан-

Таблица 2. Специфическая активность средства для активации стволовых клеток

СерияКонцен трация IgG,мг/пpo6y

Больной А Больной Б Наблюдение В

Число колоний

Число кластеров





Опыт 10–4 99 60 10 58 41 293

10–5 101 63 13 62 37 212

10–6 100 62 11 57 39 215

Контроль № 1 10–4 63 34 3 14 23 190

10–5 62 37 5 10 25 188

10–6 65 39 4 12 21 187


Оригинальные исследования 37

зачастую делает их трансплантацию невозможной.

В связи с этим, встает вопрос о стимуляции развития

собственных ММСК реципиентов как альтернатива

их пересадке. Одним из способов стимуляции может

быть использование антител к ММСК. Нами были

получены антитела к ММСК костного мозга и изу-

чено влияние иммунных глобулинов на их развитие.

Данные проведенных экспериментальных исследова-

ний указывают на возможность регуляции иммунными

глобулинами направленного действия функциональ-

ных свойств ММСК, в частности, усиление их проли-

феративной активности и способность формировать

эндостальные остеогенные стромальные клетки и

эндотелий микрососудов, то есть, структуры, обра-

зующие нишу кроветворных клеток [16,17].

Клеточные технологии в настоящее время интен-

сивно развиваются. Как считается, при этом активно

разрабатываются два направления: 1 – клеточная

терапия заболеваний и 2 – активация собственных

(эндогенных) стволовых клеток с целью стимуляции

восстановительных процессов [18]. На наш взгляд,

ксеногенные иммуноглобулины направленного дей-

ствия могут найти применение в решении обеих

указанных проблем. Например, при трансплантации

стволовых кроветворных клеток гематологическим

больным совместное введение иммуноглобулинов

и стволовых клеток позволит запускать пролифе-

ративный и дифференцировочный потенциал вво-

димых клеток, что особенно важно, так как после

супрессивной предтрансплантационной подготовки

собственные регуляторные факторы не нарабаты-

ваются в достаточном объеме, в частности, в связи

с повреждением стромального микроокружения –

основного продуцента гуморальных регуляторов кро-

ветворных стволовых клеток. Кроме того, сочетанное

введение позволит уменьшить количество вводимых

стволовых клеток сравнительно с традиционными

объемами, используемыми в подобных ситуациях.

Также возможно самостоятельное введение имму-

ноглобулинов в случаях миелодепрессии, в основе ко-

торой лежит не дефект стволовых клеток, а имеется

обусловленная различными причинами недостаточная

продукция стимуляторов развития стволовых клеток.

В указанных ситуациях введение антител направлен-

ного действия приводит к стимуляции процессов про-

лиферации и дифференцировки собственных, эндо-

генных стволовых кроветворных клеток.

В заключение следует отметить, что одним из

актуальных направлений современной клеточной

медицины становится создание препаратов, регули-

рующих развитие стволовых клеток в условиях по-

вреждения органов и тканей. Особую значимость при

этом приобретает разработка средств, способных вы-

водить из покоящегося состояния эндогенные ство-

ловые клетки, которые сохраняются в постнаталь-

ном периоде и ответственны за тканевую и органную

регенерацию. Указанные препараты могут быть соз-

даны на основе иммуноглобулинов направленного

действия. Представленные результаты использова-

ния поликлональных антител в качестве регуляторов

постнатальных стволовых клеток костного мозга не

противоречат этому положению. Становится очевид-

ным, что на основе антител направленного действия

возможно создание препаратов, которые будут спо-

собны целенаправленно регулировать функциональ-

ный потенциал клеток-предшественниц практически

всех органов и тканей организма.

Таким образом, использование антиCD34+ антител

с одной стороны может способствовать снижению

минимальных эффективных доз водимых стволо-

вых клеток, с другой – дает возможность проводить

трансплантации в условиях ограниченного количе-

ства стволовых клеток.

Однако, по нашему мнению, использование имму-

ноглобулинов направленного действия приобретает

исключительное значение в случаях трансплантации

гемопоэтических стволовых клеток при функциональ-

ных нарушениях стромальных клеток костного моз-

га, формирующих нишу стволовых клеток. В таких

ситуациях экзогенная стимуляция стволовых клеток

является единственным способом запуска их генети-

ческой программы дальнейшего развития. При этом

если учесть, что эти дефекты возникают у большин-

ства больных с системными заболеваниями крови, а

также, принимая во внимание то обстоятельство, что

агрессивные методы предтрансплантационной под-

готовки в онкологии, гематологии и других дисци-

плинах, приводят к повреждению стромальной ниши,

становится очевидной перспективность дальнейшей

разработки и использования иммуноглобулинов на-

правленного действия.

Как известно, длительное поддержание функ-

ционального состояния гемопоэтических стволовых

клеток в фазе покоя и индукция их развития по пути

различных линий гемолимфопоэза регулируется

внешними сигналами от специфического стромаль-

ного микроокружения костного мозга, обозначаемого

эндостально-васкулярной нишей стволовых клеток

[13–15]. Стромальные костномозговые клетки, ком-

митированные в остеогенном направлении, форми-

руют эндостальную, остеобластную нишу, которая

поддерживает ранние долгоживущие стволовые

клетки, регулирует их выход из состояния покоя,

определяет пролиферативный и дифференциро-

вочный потенциал. Эндостальная ниша находится в

тесной взаимосвязи с микрососудами, формирующи-

ми васкулярную нишу, которая поддерживает более

зрелые стволовые клетки, способные к миграции и

дифференцировке. Именно эти стромальные струк-

туры повреждаются при вышеуказанных состояниях

и процедурах. Это приводит к снижению или полному

отсутствию индуцирующих сигналов ниши для раз-

вития стволовых клеток. При этом возможны два

варианта развития событий. Первый – повреждения

ниши обратимы и для восстановления функции ниши

не требуются дополнительные факторы, кроме вре-

менных (самовосстановление, регенерация). В таких

случаях экзогенная регуляция стволовых клеток под-

держивает гемопоэз определенный период, который

необходим для восстановления функциональных

свойств ниши. Во втором случае – повреждения

ниши могут быть значительными и период восста-

новления продолжительный. В таких ситуациях не-

обходимо корригирующее вмешательство, вплоть до

создания новых ниш. В настоящее время для этих це-

лей используется трансплантация мультипотентных

мезенхимальных стромальных клеток (ММСК). Как

известно, последние являются источником развития

клеточных элементов костного мозга, формирующих

кроветворную нишу. Однако их применение сегодня

затруднено, так как окончательно не решен ряд вопро-

сов, регламентирующих их использование, в том чис-

ле – методы культивирования, тестирования направ-

ленности дифференцировки, безвредности и др., что



10. Masson S., Harrison D.J., Pervis J.N. Potential of haemopoietic

stem cells therapy in hepatology: critical review. Stem cells 2004;

22(6): 897–90.

11. Гончар В.А., Абдулкадыров К.М., Ругаль В.И. и др. Средство

для активации стволовых клеток. Патент Российской федерации

№ 227810. 26.03.2006.

12. Романенко Н.А. Заготовка и хранение ядросодержащих

клеток пуповинной крови человека. Автореф. дисс. кандидата мед.

наук. Санкт-Петербург; 2002.

13. Askmyr M., Sims N.A., Martin T.J. et al. What is the nature

of the osteoblastic haemopoietic stem cell niche? Trends in Endocrin.

Metabol. 2009; 20(6): 303–09.

14. Papayannopoulou T., Scadden D. Stem-cell ecology and stem

cells in motion. Blood 2008; 111: 3923–30.

15. Zhang J., Nin C., Ye L. et al. Identification of the haemopoietic

stem cell niche and control of the niche size. Nature 2003; 425:

836–41.

16. Барановский Ф.Ю., Каныкин А.Ю. Мазуркевич Е.А. и др.

Мезенхимальные стволовые клетки при травме кости. Материа-

лы 8 национального конгресса «Человек и его здоровье». Санкт-

Петербург; 2003.

17. Gonchar V.A., Rugal V.I. The new preparation as stimulator of

calcified tissue regeneration. Calc. Tissue 2000; 66: 91.

18. Зорин В.Л., Черкасов В.Р., Зорина В.И. и др. Характеристи-

ка мирового рынка клеточных технологий. Клеточная транспланто-

логия и тканевая инженерия 2010; 5(3): 96–115.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Lim P., Tow A. Recovery and Regeneration after Spinal Cord in

jury. Ann. Acad. Med. Sinkapure 2007; 36: 49–57.

2. Thomas E.D. Bone marrow transplantation from a personal

viewpoint. Int. J. Hematol. 2005; 23: 463–70.

3. Anversa P. Cardiac regeneration. J. Am. Coll. Cardiol. 2006;

47(9): 1769–76.

4. Charwat S., Gyongyo M., Lana I. et al. Role of adult bone

marrow stem cell in the repair of ischemic myocardium. Exp. Hematol.

2008; 36: 672–80.

5. Yao K., Huang R., Qian J. et al. Administration of intracoronary

bone marrow mononuclear cells in chronic myocardial infarction

improves diastolic function. Heart 2008; 94: 1147–53.

6. Baron F., Moris M., Sandmaier B. et al. Graft-versus-tumor

effects after allogenic hematopoietic cell transplantation with

nonmyeloablative conditioning. J. Clin. Oncol. 2005; 23(9): 1993–

2003.

7. Carnevale-Shianca F., Ricchiardi A., Capaldi A. et al. Allogenic

haemopoietic stem cells transplantation in solid tumors. Transplant.

Proc. 2005; 37(6): 2664–6.

8. Metz I., Lukinetti C.F., Openshaw H. Autologous haemopoietic

stem cells transplantation fails to stop demyelination and

neurodegeneration in multiple sclerosis. Brain 2007; 130(5):

1254–62.

9. Lim P., Tow A. Recovery and Regeneration after Spinal Cord in

jury. Ann. Acad. Med. Sinkapure 2007; 36: 49–57.

Поступила 10.06.2011

Documents

РЕГУЛЯЦИЯ РАЗВИТИЯ ПОСТНАТАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА КСЕНОГЕННЫМИ ИММУННЫМИ ГЛОБУЛИНАМИ