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Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos

VALIDACIÓN DEL MÉTODO ANALÍTICOPARA LA DETERMINACIÓN DE 3 VITAMINASHIDROSOLUBLES EN UN SUPLEMENTO VITAMÍNICO

Iverlis Díaz Polanco1 y Ofelia Fariñas Suárez2

RESUMEN

Se presentan los resultados obtenidos en la validación de un método analíticocromatografía líquida de alta resolución, para la determinación de tiammononitrato, piridoxina clorhidrato y nicotinamida en el suplemento nutricionneovitamin II, el cual se diseñó para separar las vitaminas entre sí, conutilización de una columna RP-18 de 25 cm y un detector UV-Visible. Dichmétodo se empleó para el control de la calidad y la estabilidad de este produEl método fue validado siguiendo una metodología de trabajo elaborapreviamente en un Protocolo de Validación, donde se analizaron diferenparámetros como son: linealidad, exactitud, precisión, selectividad, límitesdetección y cuantificación, adecuación del sistema y estabilidad de las solucioSe obtuvieron resultados satisfactorios y se comprobó de esta forma la valdel método analítico.

Descriptores DeCS: SUPLEMENTOS DIETETICOS/análisis; TIAMINA/análisis;PIRIDOXINA/análisis; NIACINAMIDA/análisis; CALIDAD DE LOS MEDI-CAMENTOS; ESTABILIDAD DE MEDICAMENTOS; CROMATOGRAFIALIQUIDA DE ALTA PRESION/métodos.

Rev Cubana Farm 2000;34(2):93-9

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El neovitamin II es un suplementomultivitamínico esencial como requerimiento nutricional para un crecimientonormal del organismo humano, es administrado fundamentalmente a embarzadas, ancianos y pacientes que presenestados hipovitamínicos. Está constituid

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por tiamina mononitrato (3,85 mg), nico-tinamida (22 mg), piridoxina clorhidrato(2,5 mg), riboflavina (1,84 mg), ácido fólico(0,325 mg), vitamina A palmitato (32,5 mg) ycianocobalamina (0,072 mg).

Una de las grandes dificultades en edesarrollo de técnicas analíticas par

1 Investigadora Aspirante.2 Investigadora Agregada.

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complejos vitamínicos es contar cométodos específicos, principalmente si lmétodos a utilizar se emplearan en estudde estabilidad.

Aparecen por primera vez reportaden la Farmacopea de los Estados UnidEdición 23, técnicas oficiales parsuplementos nutricionales, de manera qse determinan las vitaminas por crmatografía líquida de alta resoluciónsimultáneamente con el resto de lvitaminas hidrosolubles.2

El objetivo del presente trabajo edemostrar la validez del método anatico desarrollado en el Departamende Productos Naturales del Centro Investigaciones y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM) para la determinación dlas vitaminas hidrosolubles: tiaminmononitrato, piridoxina clorhidrato y nicotinamida presentes en el neovitamin Para ello se seleccionaron una serie parámetros a determinar, como solinealidad, exactitud, precisión, selectividad, límites de detección y cuantficación, adecuación del sistema estabilidad de las soluciones.

MÉTODOS

Todas las determinaciones se relizaron en un cromatógrafo líquido de alresolución equipado con una columna fase reversa LiChrosorb RP-18, de 25 cmlongitud, un detector UV-Vis a una longitude onda de 280 nm, un flujo de alrededor1 mL/min y un loop de 20 µL.

Entre los reactivos y solucioneutilizados se encuentran agua purificadbuffer de hidrógeno fosfato de potasi0,03 mol/L y pH 2,7 la fase móvil buffer--metanol (99-1) y las soluciones dreferencia de cada vitamina:

– Estándar de tiamina mononitrato: spesó con exactitud 38,5 mg de tiamin

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mononitrato, se transfirió cuantitativa-mente a un matraz aforado de 100 mL, seañadió 70 mL de agua, se agitó hastacompletar disolución y se llevó a volumencon el mismo solvente (solución T).

– Estándar de piridoxina clorhidrato: sepesó con exactitud 25,0 mg de piridoxinaclohidrato, se transfirió cuantitativamentea un matraz aforado de 100 mL, se añadió70 mL de agua, se agitó hasta completadisolución y se llevó a volumen con elmismo solvente (solución P).

– Estándar de nicotinamida: se pesó conexactitud 220,0 mg de nicotinamida, setransfirió cuantitativamente a un matrazaforado de 100 mL, se añadió 70 mL deagua, se agitó hasta completar disolucióny se llevó a volumen con el mismosolvente (solución N).

– Solución E: se tomaron alícuotas de 5,0 mLde cada una de las soluciones T, P y N, strasvasaron cuantitativamente a unmatraz aforado de 25 mL y se llevó avolumen con agua.

Métodos analíticos para la determinaciónde los parámetros a estudiar

Los parámetros a estudiar se seleccionaron en función de las característicasy de los objetivos del método analíticoutilizado y el rango de concentracionesen que se encuentra cada vitamina en lformulación. La metodología aplicada alanálisis de cada parámetro fue descritapor Mestony5 (Analyt ical MethodsValidation,1991), Loftus Bernard T3 yCastro CM.4

Linealidad. Se analizó sobre solu-ciones de referencia a las concentra-ciones de 50, 80, 100, 120 y 150 % de lacantidad declarada para cada vitamina. Eanálisis se realizó por duplicado. De lassoluciones de referencia de cada vitamina

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se tomaron alícuotas, se transfirieroncuantitativamente a un matraz aforado yllevó a volumen con agua.

Las áreas obtenidas para caconcentración se procesaron segúnmétodo estadístico MICROSTA; sdeterminó el coeficiente de correlación y aplicaron las pruebas de linealidadproporcionalidad.

Exactitud. Se prepararon 5 muestrapor duplicado a las concentraciones 50, 80, 100, 120 y 150 % de la cantiddeclarada para cada vitamina. Para preparación de las muestras se pesó exactitud alrededor de 127,0 mg de polde placebo equivalente a una tableta,transfirió cuantitativamente a un matraaforado de 50 mL, se añadió 20 mL de agse agitó durante 10 min y se adicionaralícuotas de las soluciones T, P y N haobtener las concentraciones en estudio.llevó a volumen con el mismo solvente y filtró por papel de filtración lentadesechando los primeros mililitros dfiltrado.

Se determinó la recuperación mediael porcentaje de recobro y la desviaciestándar relativa (DER) entre las concetraciones obtenidas para concentracteórica estudiada.

Precisión. Este parámetro se deteminó mediante los ensayos de repetibilidy reproducibilidad.

Para el ensayo de repetibilidad seleccionó un lote industrial, con el cual procedió de la forma siguiente: se prpararon 6 muestras a una concentración100 % de la cantidad declarada para cavitamina y se analizó ese día por el mismanalista.

En ensayo de reproducibilidad sanalizó con el mismo lote utilizado para repetibilidad y se prepararon 3 muestrala concentración del 100 % de la cantiddeclarada para cada vitamina, las queanalizaron en 2 d diferentes.

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Preparación de las muestras. Setrituraron no menos de 20 tabletas y se pescon exactitud el equivalente a la masapromedio, se transfirió cuantitativamente aun matraz aforado de 50 mL, se añadi30 mL de agua, se agitó durante 10 min, sllevó a volumen con el mismo solvente y sefiltró por papel de filtración lenta,desechando los primeros mililitros delfiltrado. En ambos ensayos se determinó lDER entre las concentraciones obtenidaen los 2 d de análisis.

Selectividad. El estudio de esteparámetro se demostró mediante 3 muestrplacebos, realizando comparaciones entrlas soluciones de referencia antes después de sometidas a un proceso ddegradación. Para esto las soluciones dreferencia se analizaron recién preparaday posteriormente se almacenaron en frascode cristal ámbar a 70 °C durante 6 d; afinalizar este tiempo se analizaronnuevamente por triplicado. Las muestras sprepararon como se indica en el parámetrde exactitud sin la adición de las alícuotade las soluciones de referencia.

Límites de detección y cuantificación.Se realizó posteriormente a la determinaciódel parámetro linealidad, donde se aplicóuna calibración lineal del tipo y = bx + a. Seutilizó para determinar dichos parámetrosla medición de 3 soluciones de referencide las vitaminas en estudio, tomando compatrón la concentración del 50 % y 2 concentraciones por debajo de ésta, 20 y 35 %El análisis se realizó por triplicado para cadconcentración.

Los resultados obtenidos se evaluaroestadísticamente calculando la media y lDER de las concentraciones; además scalculó la recta de regresión tomando comY la respuesta y como X las concen-traciones. Se definió la ecuación y sedeterminó la respuesta a concentración cepor extrapolación al origen de la recta

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calculada. El valor de Y será Ybl. Sdeterminó la desviación estándar de lrespuestas a concentración cero pextrapolación al origen de la recta calculadtomando como Y la DER de las respuesty como X las concentraciones. El valor dY será Sbl. Se calcularon los límites ddetección y cuantificación mediante lafórmulas siguientes:

Ybl + 3Sbl 1

b √n

Ybl + 10Sbl 1

b √n

donde:

Cld: límite de detección (µg/mL)Clc: límite de cuantificación (µg/mL)b: valor de la pendiente de la recta dcalibraciónn: número de muestras

Adecuación del sistema. Este pará-metro se analizó con 6 muestras de un loindustrial a la concentración del 100 % de cantidad declarada para cada vitamina. preparación de las muestras y lasoluciones de referencia se realizó comoindica en el parámetro de exactitud. En locromatogramas obtenidos se determinófactor de cola (T), la resolución (R) y laprecisión de la inyección (Cv). Los cálculose realizaron con las fórmulas siguientes

T = W.05/2f

donde:

W . 05: ancho del pico al 5 % de la alturaf: distancia de la orilla principal al picomáximo

R = 2t2 – t1 / W2 + W1

Cld = ×

×Clc =

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donde:

t 2 y t1: tiempos de retenciónW

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1: ancho de las porciones extrapolada

Cv = S/X (100)

donde:

S: desviación estándar absolutaX: media

Estabilidad de las soluciones. Debidoa que las vitaminas se degradan con grfacilidad, se determinó este parámetro. Paello se midieron 3 soluciones de referencde cada vitamina a las 3, 6 y 9 h de spreparación, almacenadas en matracaforados protegidos de la luz.

En el análisis de cada parámetro scalculó la concentración de las vitaminasexpresada en porcentaje, según la fórmusiguiente:

C (%) = Cm/Ct (100)

donde:

Cm: valor promedio de la concentración dtiamina mononitrato, nicotinamida ypiridoxina clorhidrato, según corresponden microgramos por mililitro.Ct: valor promedio de la concentraciónteórica de tiamina mononitrato, nicotinamidy piridoxina clorhidrato, según corresponden microgramos por mililitro.

RESULTADOS

Como resultado del análisis de lalinealidad del método analítico seobtuvieron valores de coeficiente decorrelación r menor o igual a 0,99, interceptde la recta de regresión a cero y DER meno igual al 5 %.

Los resultados del análisis del parámetro de exactitud se muestran en la tabla

TABLA1. Exactitud del método cromatográfico

Concentraciones Tiamina mononitrato Piridoxina clorhidrato Nicotinamida % % rec. DER % rec. DER % rec. DER

50 99,0 0,5 99,0 0,7 99,0 1,980 98,6 0,5 99,3 1,0 98,9 1,6

100 98,0 0,8 98,9 1,3 98,0 1,2120 98,5 0,7 98,9 1,4 98,5 1,3150 99,2 0,9 99,0 1,1 98,6 1,6

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El análisis de los ensayos drepetibilidad y reproducibilidad sepresentan en las tablas 2 y 3 con valorde DER menores que los criterios daceptación establecidos (menor o igual q2,0 % y menor e igual que 3,0 %, respetivamente).

TABLA 2. Precisión del método cromatográfico.Repetibilidad

Vitaminas X (%) DER (%)

Tiamina mononitrato(70,0 µg/mL) 98,7 1,00Piridoxina clorhidrato(45,0 µg/mL) 95,7 0,80Nicotinamida(440,0 µg/mL) 92,0 0,75

TABLA 3. Precisión del método cromatográfico.Reproducibilidad

Concentraciones (X, %) DíasVitaminas 1er. d 2do. d

Tiamina mononitrato 93,6 92,0DER 1,13Piridoxina clorhidrato 94,3 93,0DER 1,0Nicotinamida 93,0 95,0DER 2,0

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En el estudio del parámetro deselectividad se observó que las vitaminasen solución disminuyen su concentracióncuando son sometidas a un proceso ddegradación térmica. En el caso de la tiaminamononitrato se parte de una concentracióninicial de 103,6 % y se obtiene unaconcentración final de 86,0; la piridoxinaclohidrato varía su concentración desde101,0 hasta 90,5 % y la nicotinamida de104,0 a 103,0 %. Además los excipientes dela formulación no absorben a la mismalongitud de onda de los principios activos.

Los límites de detección y cuanti-ficación obtenidos fueron los siguientes:

– tiamina mononitrato: Cld = 0,0055 µg/mLy Clc = 0,0475 µg/mL

– piridoxina clohidrato : Cld = 0,059 µg/mLy Clc = 0,1436 µg/mL

– nicotinamida: Cld = 0,926 µg/mL yClc= 2,97 µg/mL

La tabla 4 detalla los valores obtenidosen cuanto a factores de cola, resolución yprecisión de la inyección.

TABLA 4. Adecuación del sistema

Vitaminas Factor de cola (T) Precisión de la inyección (Cv) Resolución (R)

Tiamina mononitrato 1,00 0,24 Tiamina-nicotinamida 1,97Piridoxina clorhidrato 1,12 0,20 Nicotinamida-piridoxina 1,64Nicotinamida 0,95 0,04

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Todas las vitaminas se mantieneestables en solución hasta las 9 h despde su preparación, excepto la tiaminmononitrato que ya a las 6 h se encuenen menos del 90 %.

DISCUSIÓN

Como resultado del análisis de linealidad del método, dicho parámetrcumplió con los criterios de aceptacióestablecidos, y hubo una relación lineentre las concentraciones de las vitaminestudiadas y las áreas obtenidas para cuna.

Como se observa en la tabla 1, obtuvieron valores de desviación estándrelativa y porcentaje de recobro (% redentro de los límites establecidos en protocolo de validación (DER menor o iguque 2,0 % y % rec = 97,0 - 103,0 %, y hubuna relación lineal entre los valores dreferencia, por lo que se considera quemétodo es exacto.

En el parámetro de repetibilidad, 6 dterminaciones de cada vitamina fueronecesarias para asegurarse que el métes preciso, con valores de desviaciestándar relativa menores que 2,0 %. Segúnlos resultados obtenidos en la reprducibilidad se puede concluir que emétodo es reproducible cambiando el dde análisis, ya que en ambos días obtuvieron valores de coeficientes dvariabilidad menores que 2,0 %.

El método cromatográfico es selectivy diferencia los principios activos de su

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productos de degradación, además loexcipientes de la formulación no interfierenen la determinación de las vitaminas.

El método analítico cumple con elparámetro de límites de detección ycuantificación, ya que permite detectar ycuantificar concentraciones muy bajas delas 3 vitaminas presentes en el neovitamin II.

El sistema cromatográfico empleado esadecuado para la determinación de dichavitaminas hidrosolubles en el neovitaminII, pues las variables analizadas en eparámetro de adecuabilidad cumplieron conlos límites establecidos (T = 0,85-1,15; R>1,5y Cv menor o igual que 2,0 %), o sea, seobtienen picos finos, bien definidos y conbuena resolución entre ellos.

Protegiendo de la luz las soluciones decada vitamina se logra una adecuadaestabilidad de éstas, ya que conservan lacaracterísticas físico-químicas y susconcentraciones iniciales no varíanconsiderablemente.

Teniendo en cuenta los resultadosobtenidos, la técnica analítica propuestapara el control de la calidad y estudio deestabilidad del neovitamin II, es válida paraobtener resultados satisfactorios en las3 vitaminas estudiadas; así se demuestren los parámetros de linealidad, precisiónexactitud, límites de detección, cuanti-ficación y especificidad. Como métodocromatográfico es adecuado y las solu-ciones son estables de forma que garantizasu integridad durante un largo período.

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SUMMARY

The results obtained in the validation of an anlytical method by high resolutiliquid chromatography for the determination of thiamine mononitratepyridoxine hydrochloride and nicotinamide in the Neovitamin dietary supplemeare presented. It was designed to separate vitamins among themselves, usRP-18 column of 25 cm and a UV Visible detector. This method was used controlling the quality and stability of the product. This method was validate

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according to a working methodology that was previously prepared in a ValidatioProtocol where paramaters such as lineality, accuracy, precision, selectivilimits of detection and quantitation, system adequacy and the solution stabilwere analyzed. The results were satisfactory and the validity of the analyticmethod was proved.

Subject headings: DIETARY SUPPLEMENTS/analysis; THIAMINE/analysis;STABILITY; CHROMATOGRAPHY, HIGH PRESSURE LIQUID/methods.

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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 4 de diciembre de 1999. Aprobado: 21 de enero del 2000.Lic. Iverlis Díaz Polanco. Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos. Calle 19 de mayoNo.13 esquina a Amézaga, municipio Plaza de la Revolución, Ciudad de La Habana, Cuba.

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