TEKNIK PEWARNAAN dan INOKULASI MIKROBA.docx

LAPORAN PRAKTIKUM

BIOLOGI/MIKROBIOLOGI LINGKUNGAN

TEKNIK PEWARNAAN DAN INOKULASI MIKROBA

Oleh:

Maulidhyanti

NIM : 082.11.027

Kelompok: 1A

Asisten:

Septian Maulana

Serra Annisa

Ghoribati Ashfiya

Jurusan Teknik Lingkungan

Fakultas Arsitektur Lansekap dan Teknologi Lingkungan

Universitas Trisakti

Jakarta

2012

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Mikroorganisme yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur

dan sifat-sifat yang khas, termasuk bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak

berwarna dan kontras dengan air. Untuk melihat dan mengamati bentuk sel

bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit karena selain bakteri itu tidak

berwarna juga transparan dan sangat kecil, sehingga untuk

mengidentifikasinya dilakukan dengan metode pengecatan atau pewarnaan

sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Hal tersebut

juga berfungsi untuk mengetahui sifat fisiologisnya yaitu mengetahui reaksi

dinding sel bakteri melalui serangkaian pengecatan. Oleh karena itu teknik

pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam

penelitian-penelitian mikrobiologi.

Dalam penentuan identifikasi bakteri untuk melihat morfologi atau

bentuk bakteri diperlukan suatu pewarnaan dengan menggunakan zat-

zat warna yang telah ditentukan sesuai dengan metode masing-masing

pewarnaan. Zat warna yang paling banyak digunakan adalah kristal violet,

biru metilen, gentian ungu, safranin dan juga tinta cina. Pada pewarnaan

tertentu misalnya pewarnaan Gram dapat digunakan sebagai petunjuk awal

dari identifikasi bakteri dalam penentuan genus sampai spesies bakteri

dengan melihat bentuk dan warna, flagella, spora dan kapsul bakteri. Untuk

menyiapkan bakteri agar dapat diwarnai, dibuat sediaan di atas kaca objek

dan biasanya dinamakan pulasan.

Berdasarkan hal tersebut diatas, maka maka dilakukanlah praktikum

ini untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme baik itu dengan cara

pengecatan sederhana, pengecatan negatif maupun pengecatan gram serta

mengetahui morfologi mikroorganisme.yang akan dilakukan.

1.2. Tujuan

Adapun tujuan dari percobaan ini adalah :

1. Mempelajari teknik pewarnaan sederhana dan pewarnaan gram untuk

pengamatan mikroba.

2. Mempelajari teknik pewarnaan pewarnaan negatif dan pewarnaan spora

untuk pengamatan mikroba.

3. Mengetahui dan mempelajari morfologi atau bentuk dan strukur bakteri

dari hasil pengamatan.

BAB II

ALAT DAN BAHAN

ALAT BAHAN

Pembakar bunsen Biakan murni dari bakteri hasil isolat

mikroba udara pada agar miring.

Kawat ose Air suling

Tang penjepit kayu Kristal violet

Mikroskop Lugol

Spatula Alkohol 95%

Batang pengaduk Larutan iodium garam

Pipet steril Safranin

Kaca preparat Tinta cina

Minyak imersi Biakan murni Klebsiella sp

Malachite green

Biakan murni Bacillus aureus

BAB III

CARA KERJA

3.1. Pewarnaan sederhana

a. Bersihkan kaca preparat dengan air kemudian dengan alkohol untuk

fiksasi diatas pembakar bunsen.

b. Inokulasikan bakteri pada medium agar miring ke kaca preparat dengan

menggunakan kawat ose sampai menimbulkan noda.

c. Teteskan larutan kristal violet pada noda di kaca preparat sebanyak 1 tetes.

d. Diamkan sejenak, cuci dengan air mengalir, kemudian angin-anginkan

sampai kering.

e. Tambahkan minyak imersi.

f. Amati dengan menggunakan mikroskop.

3.2. Pewarnaan gram





c. Teteskan larutan kristal violet pada noda di kaca preparat sebanyak 1 tetes.

d. Diamkan sejenak, cuci dengan air mengalir, kemudian angin-anginkan.

e. Setelah kering berikan 1 tetes lugol, cuci kembali dengan air mengalir.

f. Bilas kaca preparat dengan mencelupkan ke alkohol.

g. Berikan 1 tetes larutan safranin, kemudian cuci dengan air mengalir.

h. Amati dengan menggunakan mikroskop.

3.3. Pewarnaan negatif



b. Teteskan sebanyak 1 tetes tinta cina diujung sebelah kiri kaca preparat.

c. Inokulasikan biakan murni mikroba Klebsiella sp dengan menyampurkan

pada noda tinta cina menggunakan kawat ose.

d. Ratakan tinta cina dan bakteri tersebut dengan ujung kaca preparat lainnya

ke arah kanan, sampai menyebar secara merata.

e. Amati dengan menggunakan mikroskop.

3.4. Pewarnaan spora





c. Teteskan larutan malachite green pada noda di kaca preparat sebanyak 1

tetes, tunggu sejenak (± 1 menit)

d. Kemudian cuci dengan air mengalir, lalu angin-anginkan.

e. Setelah kering berikan 1 tetes safranin, lalu cuci kembali dengan air

mengalir.

f. Panaskan hingga kering.

g. Amati dengan menggunakan mikroskop.

3.5. Inokulasi mikroba ke cawan petri

a. Gambarkan segi enam beraturan dan sebuah garis zig-zag pada salah satu

sisinya ke arah dalam pada sisi bawah cawan petri yang telah berisikan

medium agar NA untuk membuat pola.

b. Bakar kawat ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup

(ujung) sampai berpijar merah.

c. Biarkan selama beberapa detik sampai pijar menghilang, kemudian segera

ambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, buka penutupnya dengan

ketiga jari tengah, manis dan kelingking sedangkan jari telunjuk dan ibu

jari memegang kawat ose.

d. Dekatkan bibir tabung reaksi dengan cara memutar tabung sehingga semua

bagian bibir tabung terkena api.

e. Segera masukkan kawat ose ke dalam cawan petri yang diberi pola segi

enam sebelumnya, kemudian oleskan kultur bakteri ke media agar sesuai

dengan pola yang telah digambarkan lalu segera keluarkan. Usahakan

ketika memasukkan kawat ose lakukan dengan perlahan agar tepat sesuai

dengan pola yang telah ditentukan dan lakukan di dekat pembakar bunsen.

f. Ambil tabung reaksi lainnya yang akan diinokulasi, buka tutupnya dengan

dan bakar bibirnya dengan cara yang sama.

g. Segera masukkan kawat ose ke dalam tabung tadi

h. Bakar bibir tabung reaksi dan tutup

i. Bakar kembali kawat ose

j. Lakukan kembali dengan cara yang sama apabila diperlukan dilusi atau

pengenceran.

BAB IV

HASIL PENGAMATAN

4.1. Pewarnaan sederhana

GAMBAR PENGAMATAN

Sampel : Lab mikro (1)

Bentuk : coccus

Bakteri : Streptococcus sp

Warna : ungu kebiruan


Bentuk : coccus

Bakteri : Staphylococcus aureus

Warna : biru keunguan

Sampel : Kamar mandi lt 8 (1)

Bentuk : coccus


Warna : ungu muda


Bentuk : basil

Bakteri : Actymonoues Basiv

Warna : ungu

Sampel : Basement TL

Bentuk : coccus



GAMBAR PENGAMATAN

Sampel : Himpunan TL

Bentuk : coccus



Sampel : Gedung M

Bentuk : basil

Bakteri : Streptobasil

Warna : biru tua

4.2. Pewarnaan gram

GAMBAR PENGAMATAN


Bentuk : coccus

Bakteri : Streptococcus sp

Warna : ungu tua – gram positif


Bentuk : coccus

Bakteri : Enterococcus



Bentuk : coccus



GAMBAR PENGAMATAN


Bentuk : basil

Bakteri : Actymonoues Basiv

Warna : ungu – gram positif

Sampel : Basement TL

Bentuk : coccus


Warna : ungu – gram positif

Sampel : Himpunan TL

Bentuk : coccus



Sampel : Gedung M

Bentuk : basil

Bakteri : Streptobasil


4.3. Pewarnaan negatif

GAMBAR PENGAMATAN

Kelompok : 1A

Bentuk : coccus

Bakteri : Klebsiella sp

Warna : putih-hitam

GAMBAR PENGAMATAN

Kelompok : 2A

Bentuk : coccus


Warna : putih-hitam

Kelompok : 3A

Bentuk : coccus


Warna : putih-hitam

Kelompok : 4A

Bentuk : coccus


Warna : putih-hitam

4.4. Pewarnaan spora

GAMBAR PENGAMATAN

Kelompok : 1A

Bakteri : Bacillus

Letak spora : sentral

Kelompok : 2A

Bakteri : Bacillus


GAMBAR PENGAMATAN

Kelompok : 3A

Bakteri : Bacillus


Kelompok : 4A

Bakteri : Bacillus


4.5. Inokulasi mikroba

GAMBAR PENGAMATAN

Praktikan : Evin Eginer

Terdapat bakteri dengan pola

osekan segi enam namun kurang

jelas.

Praktikan : Maulidhyanti


osekan segi enam cukup jelas.

Praktikan : Adzra Raihana

Terdapat bakteri namun dengan

pola segi enam yang kurang jelas.

Praktikan : David Jonatan



jelas

GAMBAR PENGAMATAN

Praktikan : Annisa Amadreja


osekan yang kurang jelas, tidak

membentuk segi enam.

Praktikan : Adityo Jati K



jelas

Praktikan : Anissa Riski F



jelas

Praktikan : Hendri Nofriandi

Terdapat bakteri namun dengan

pola segi enam yang kurang jelas.

BAB V

PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini hal yang dilakukan adalah pewarnaan bakteri yang

digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar

belakang, sehingga dapat mempertajam bentuk sel-sel mikroba itu sendiri. Teknik

pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu

pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan

struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan

menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang

sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang

menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba

disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya

mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel.

Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan

pengecatan kapsul.

Pertama-tama teknik pewarnaan yang dilakukan adalah pewarnaan

sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna dengan

tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi

dan susunan selnya . pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada

umumnya antara lain kristal violet , metylen blue , karbol , fuchsin , dan safranin.

Yang kedua adalah pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan

terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan

latar belakangnya, metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode

perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke

dalam sel-sel bakteri melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan atau

nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna(negatif).

Kemudian yang ketiga pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang

digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri

gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak

berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan

kehilangan zat warna crystal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu

diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah.

Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi

dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain :

crystal violet, alkohol, safranin, dan iodine.

Lalu yang keempat pewarnaan spora merupakan pewarnaan dengan

menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasil pewarnaannya akan

muncul warna hijau pada sporanya, serta warna merah pada sel vegetatifnya yaitu

pada Bacillus subtitulis.

Prinsip pewarnaan sederhana didasarkan pada zat warna yang digunakan

hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut yang merupakan

suatu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum.

Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung

dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru

melainkan ke dalam latar belakangnya.

Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel

bakteri ; sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna

dan penambahan larutan pencuci.

Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang

menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan

muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya.

Crystal violet atau ungu gentian adalah pewarna triarylmethane. Pewarna

ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri.

Crystal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan

sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal.

Nigrosin/tinta cina adalah campuran dari pewarna sintesis hitam yang

dibuat dengan memanaskan campuran nirobenzena, anilin, dan hidroklorida.

Didalam praktikum ini, nigrosin digunakan untuk pewarnaan negatif bakteri.

Bentuk dan organisme yang terlihat sebagai warna bebas menguraikan terhadap

latar belakang gelap. Keuntungan dari menggunakan metode ini daripada noda

positif biasa seperti fuchsin, metilen blue, atau carbol, ialah bahwa fiksasi

sebelumnya oleh panas atau alkohol tidak diperlukan sehingga organisme terlihat.

Selain itu pewarnaan negatif dengan nigrosin dapat mengungkapkan beberapa

mikroorganisme yang tidak dapat diwarnai dengan metode biasa.

Lugol’s yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari

iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik

dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen

untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes medis.

Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi.

Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan.

Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Persiapan safranin komersial sering

mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai

indikator redok dalam kimia analitik.

Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel

agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses

pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel

bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya.

Menurut hasil pengamatan, pada pewarnaan sederhana dikemukakan

bakteri dengan bentuk basil dan coccus yang berwarna ungu. Pada pewarnaan

negatif, tidak ditemukan terlalu banyak bakteri, ditemukan bakteri dengan bentuk

coccus dan pewarnaan negatif mewarnai belakangnya berwarna kehitaman dan

bakteri berwarna putih kekuningan. Pada pewarnaan gram tidak ditemukan bakteri

jenis gram negatif dengan warna merah dan hanya memiliki bentuk coccus dengan

warna ungu tua yaitu menunjukkan bakteri gram positif. Sedangkan, pada

perwarnaan spora yang menggunakan malachite green dan safranin, spora

seharusnya berwarna hijau, tetapi pada hasil pengamatan yang terlihat hanya

sedikit dari sel vegetatifnya yang terlihat..

Beberapa faktor kesalahan kami pada praktikum kali ini antara lain

pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang

maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati,

dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas

zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air

Berikut adalah hasil pengamatan dari pertumbuhan bakteri pada cawan

petri yang telah diinokulasikan sebelumnya yaitu :

Hari ke-2, Jumat, pukul 11.00 wib

Terdapat koloni bakteri yang tumbuh sesuai dengan pola segi enam yang

telah dibuat dengan proses inokulasi pada 2 hari sebelumnya yaitu Rabu

tanggal 10 Oktober 2012. Namun ada juga beberapa hasil pertumbuhan

yang tidak sesuai dengan pola yang telah ditentukan. Hal itu diakibatkan

karena terjadinya kesalahan pada saat inokulasi yang kurang

memperhatikan ketepatan mengikuti jalur pola, proses fiksasi yang tidak

benar, dan juga rusaknya medium akibat pengolesan kawat ose yang

terlalu kuat pada medium agar.

Dengan mempelajari dan mempraktekkan mengenai teknik pewarnaan dan

inokulasi mikroba kali ini, maka kita akan dapat melihat dan mengetahui bentuk

atau morfologi bakteri sehingga kita dapat mengenali bakteri tersebut.

BAB VI

KESIMPULAN

Dari hasil praktikum mikrobiologi isolasi bakteri dapat disimpulkan :

Faktor-faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi,

peluntur warna , substrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat

warna penutup

Pewarnaan sederhana digunakan untuk melihat bentuk dan struktur sel

bakteri dengan menggunakan satu jenis pewarna seperti safranin atau

kristal violet, sedangkan pewarnaan gram digunakan untuk membedakan

antara bakteri gram (+) dan gram (-) dengan lebih dari satu zat warna.

Bakteri gram negatif pada teknik pewarnaan akan menghasilkan warna

merah dan bakteri gram positif akan menghasilkan warna ungu.

Larutan zat warna yang digunakan pada percobaan perwarnaan antara lain:

alkohol, carbol fuchsin, crystal violet, nigrosin, malachite green, lugol’s

iodida, dan safranin.

DAFTAR PUSTAKA

Moerdjoko, Sintorini dan Rinanti Nugroho, Astri. 2003. Penuntun Praktikum

Biologi/Mikrobiologi Lingkungan. Jakarta: Universitas Jakarta

Irawan, 2008. Teknik Pewarnaan Mikroba. http://wordbiology.wordpress.com

Diakses pada tanggal 15 Oktober 2012

Anonymous, 2012. Pewarnaan Bakteri. http://artikelteknikkimia.blogspot.com

Diakses pada tanggal 1 Oktober 2012

http://wordbiology.wordpress.com/

Documents

TEKNIK PEWARNAAN dan INOKULASI MIKROBA.docx