ANGGA ZAKHARIA

108114100

PEWARNAAN BAKTERI GRAM POSITIF DAN NEGATIF

A. Pewarnaan Bakteri Gram Positif

Organism yang dapat menahan kompleks pewarna primer gentian violet

sampai pada akhir prosedur (sel-sel tampak biru gelap atau ungu), disebut Gram

positif.

Dinding sel yang lebih tebal pada bakteri Gram positif menyusut oleh

perlakuan alcohol karena terjadinya dehidrasi, menyebabkan pori-pori dinding sel

menutup sehingga mencegah larutnya kompleks gentian violet pada langkah

pemucatan. Bila sel-sel gram positif diberi perlakuan dengan enzim lisozim untuk

menyingkirkan dinding sel setelah pewarnaan dengan kompleks UK-Y (ungu kristal

yodium), maka struktur yang dihasilkannya itu akan terwarnai oleh kompleks UK-Y.

namun, mereka tidak mudah dipucatkan oleh etanol. Semua ini merupakan bukti

bahwa dinding sel pada bakteri gram positif merupakan situs tempat zat warna ungu

Kristal tertahan.

B. Pewarnaan Bakteri Gram Negatif

Organism yang kehilangan kompleks warna ungu Kristal pada waktu

pembilasan dengan alcohol (sehingga bila diperiksa ternyata kosong) namun demikian

terwarnai oleh pewarna tandingan, fuchsin/safranin (sel-sel tampak merah muda),

disebut Gram negative.

Sel-sel Gram negative mempunyai kandungan lipid yang lebih tinggi pada

dinding selnya dan lipid pada umumnya larut dalam alcohol dan aseton. Larutnya

lipid oleh pemucat yang digunakan dalam pewarnaan Gram diduga memperbesar

pori-pori dinding sel sehingga proses pemucatan pada sel-sel Gram negative

berlangsung lebih cepat.

Dinding sel bakteri gram negative mengandung peptidoglikan jauh lebih

sedikit, dan peptidoglikan ini mempunyai ikatan silang yang jauh kurang ektensif

dibandingkan dengan yang dijumpai pada dinding bakteri gram positif. Karenanya,

maka pori-pori pada peptidoglikan bakteri gram negative tetap cukup besar sekalipun

setelah perlakuan etanol sehingga memungkinkan ekstraksi kompleks UK-Y (Ungu

Kristal Yodium). UK-Y terperangkap di dalam dinding, yang tampaknya mengurangi

diameter pori-pori pada peptidoglikan dinding sel.

C. Mekanisme Pewarnaan

Prosedur pewarnaan gram dimulai dengan pemberian pewarna basa, kristal

violet. Larutann iodine kemudian ditambahkan; semua bakteri akan diwarnai biru

pada fase ini. Sel kemudian diberi alkohol. Sel gram positif akantetap mengikat

senyawa kristal violet-iodine, tetap berwarna biru; sel gram negatif warnanya hilang

oleh alkohol. Sebagai langkah terakhir, counterstain (misalnya Safranin pewarna

merah) ditambahkan, sehingga sel gram negatif yang tidak berwarna, akan mengambil

warna kontras; sedangkan sel gram positif terlihat dalam warna biru .

Pembuatan Film

Pembuatan film berperan penting dalam pengamatan morfologi. Bakteri yang terlalu

bertumpuk atau terlalu tipis di atas gelas objek akan menghasilkan gambaran yang

kurang jelas di bawah mikroskop.

Cara membuat film:

1. Bersihkan gelas objek dengan kapas beralkohol untuk menghasilkan lemak dan

mikroba yang menempel, lalu keringkan di udara.

2. Buat lingkaran kecil di bagian bawah gelas objek untuk membatasi film dengan pensil

gelas.

3. Ambil satu ose suspense bakteri secara aseptic, yaitu dengan membakar ose di atas

lampu spiritus sampai memijar, kemudian dinginkan sebentar, lalu tempelkan pada bagian

dalam dan tabung biakan sebelum mengambil suspense bakteri.

4. Buat film setipis mugnkin di atas gelas objek di dalam batasan lingkaran tadi.

5. Lakukan fiksasi dengan cara melakukan film langsung di atas api secara cepat dua

sampai tiga kali. Maksudnya ialah untuk membunuh bakteri secara cepat sehingga tidak

mengalami perubahan bentuk. Di samping itu fiksasi dapat melekatkan bakteri pada gelas

objek.

Langkah-langkah pembuatan film di atas senantiasa dilakukan sebelum kita melakukan

pengecatan.

Pengecatan:

1. Tambahkan salah satu zat warna di atas film dengan waktu yang sesuai, yaitu untuk

carbol fuchsin 15 – 20” (detik), carbol geantin violet 30 – 45”, dan methylene blue 3- 5‘

(menit).

2. Buang zat warna tersebut lalu cuci dengan mengalirkan air menggunakan botol

semprot untuk menghilangkan zat warna yang tidak terpakai,

3. Keringkan dengan kertas saring dengan cara ditempelkan perlahan ke atas film yang

telah diwarnai. Jangan menggosok film tadi dengan kertas saring.

4. Tambahkan satu tetes minyak imersi

5. Amati di bawah mikroskop dengan perbesaran kuat (lensa objektif 100x)

6. Catat dan gambar morfologi bakteri.